Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

نشكر عددا لا يحصى من الطلاب في مختبراتنا (PJD و BJM) الذين عملوا معنا على مر السنين لتحسين هذه الأساليب. شكر خاص ل Stan Person ، الذي تم تطوير هذه المنهجية تحت وصايته لأول مرة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق دعم البحوث الجامعية لكلية فيشر للعلوم والرياضيات بجامعة توسون وجسر NIGMS إلى منحة البكالوريا 5R25GM058264. هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع خلايا فيرو وفيروسات الهربس الحية من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة توسون. ويمثل الشكل 1 مخططا معمما لهذه الإجراءات.
1. بذر خلايا فيرو
<ol><li>في اليوم السابق لبدء فحص اللويحات، قم بتربسين خلايا فيرو وإعا...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

في حين أن مقايسات البلاك قديمة قدم زراعة خلايا الثدييات نفسها تقريبا ، يبدو أن كل مختبر لديه مجموعة خاصة به من البروتوكولات لتنفيذ هذا الفحص الأساسي5،6،10،11،12،13،14،15،<sup class="xref...

تعود بدايات فحوصات لوحة الفيروسات إلى الاكتشافات الأولى للفيروسات في 1890s1. تم عزل فيروس فسيفساء التبغ لأول مرة ونقله على أوراق التبغ، حيث يمكن التعرف على بقع العدوى الفردية وتحديدها كميا على أنها ناشئة عن كيان واحد من الفيروسات الحية2، والذي تم تحديده لاحقا على أنه فيروس2. وقد أتقنت الدراسات المنوية اللاحقة التي أجريت على البكتيريا والعاثيات البكتيرية التقنيات المستخدمة لتجويف هذه الفيروسات، بما في ذلك البكتيريا في مرحلة منتصف سجل النمو، والتخفيف التسلسلي لعينات العاثيات البكتيرية، والأجار العلوي مع التصور اللاحق للثقوب الحرفية (المسماة اللويحات) في العشب البكتيري3.
تأخر تراكم الفيروسات الحيوانية عن الأبحاث المثيرة التي تجرى مع العاثيات البكتيرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الطرق اللازمة لزراعة خلايا الثدييات في الثقافة لم يتم تطويرها حتى 1940s4. ومع ذلك، فإن ظهور خلايا الفئران المتنامية في غياب الكائن الحي المضيف بأكمله4 ولد حقبة جديدة في القدرة على زراعة الفيروسات وعدها. وقد تم توسيع نطاق هذا العمل من أجل انتشار وقياس فيروس التهاب الدماغ والنخاع الخيلي الغربي في خلايا الدجاج وفيروس شلل الأطفال في الخلايا البشرية5،6. ومع توسع عالم خلايا الثدييات القابلة للاستزراع، أعطى وجود مجموعة من الخلايا المضيفة المختلفة لمختلف أنواع العدوى الفيروسية العالم وفرة من الاحتمالات لدراسة جميع أنواع الفيروسات7. وشمل ذلك انتشار فيروسات الهربس البشرية وتحديدها كميا، ولا سيما فيروس الهربس البسيط-1 (HSV-1) و-2 (HSV-2)، اللذين يسببان آفات مخاطية جلدية8. الأهم من ذلك ، أن جميع اختبارات البلاك تعتمد على وجود فيروسات حية ، والتي يمكن أن تدخل الخلايا المضيفة بطريقة بوساطة المستقبلات في عينة9. بغض النظر عن انتشار وتعدد المنشورات حول تنفيذ فحوصات اللويحات5،10،11،12،13،14،15،16 ، فإن هذه الطرق ل HSV-1/-2 هي مزيج من كل من الفن والعلم. لا يمكن للمرء إجراء الفحص دون الاهتمام المناسب بكل التفاصيل في البروتوكول ، ولا يمكن للمرء أن ينفذ فحصا ناجحا دون عين مكررة للدقة في هذه العملية. تصور هذه المخطوطة واحدة من أكثر الطرق القابلة للتكرار باستمرار لمقايسات لوحة HSV-1/-2 ، مع تفاصيل دقيقة حول فن الفحص نادرا ما تتم مناقشتها.
يحصل هذا البروتوكول الحالي على وحدات تشكيل البلاك الحية (PFU) لوحدات HSV-1 و -2 بشكل موثوق. يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا Vero (الخلايا الظهارية الكلوية للقرد الأخضر الأفريقي) عند مرور منخفض (أسفل رقم الممر 155) وتزرع بشكل روتيني في alpha-MEM17 مع استكمال مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) ، L-alanyl-L-glutamine ، وخليط مضاد حيوي / مضاد للفطريات 18. يتم نشر خلايا Vero بشكل قياسي في هذا الوسط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع عند تخفيف 1/5 في كل مرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

هناك العديد من البروتوكولات المنشورة لتصحيح الفيروسات ، بما في ذلك المراجع ضمن الأدبيات الأولية للمنهجية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ فيروسات الترقيح ، مما يتطلب التركيز على مواصفاتها وصقلها. إنها طريقة صعبة بشكل لا يصدق للطلاب الجدد لإتقانها ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنها تتطلب اهتماما دقيقا بأدق التفاصيل. يجب أن يساعد هذا العرض التوضيحي لفيروسات الهربس البسيط أولئك الذين كافحوا في تصور الطريقة ، وخاصة الفروق الدقيقة فيها ، على مر السنين. في حين أن هذه المخطوطة تستند إلى نفس مبادئ منهجية الترقيم القياسية ، إلا أنها تختلف في أنها تحتوي على وصف مفصل ل (1) أفضل طريقة للتعامل مع الخلايا المضيفة لتجنب الاضطراب أثناء العملية ، (2) وسط لزج أكثر فائدة من الأغاروز للحد من انتشار الفيروسات ، و (3) إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج قابلة للتكرار بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يساعد الفيديو المصاحب في إظهار الفروق الدقيقة في العملية ، والتي غالبا ما يتم تفويتها عند توجيه الآخرين حول إجراء اختبارات اللويحات.

يوضح الجدول 1 تجربة لها أفضل النتائج. تتبع جميع التخفيفات 10 أضعاف انخفاضا بمقدار 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات. يمكن أيضا رؤية هذه الأنواع من البيانات في الشكل 2 ، وهو فحص فعلي للويحات حيث انخفض العدد القابل للعد من اللويحات في نطاق 10-4 لجميع النسخ المتماثلة الثلاث?...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

الترقيع هو طريقة روتينية تستخدم لتحديد كمية الفيروسات الحية في السكان. على الرغم من أن الترويح يتم تدريسه في كثير من الأحيان في مختلف مناهج علم الأحياء الدقيقة مع البكتيريا والعاثيات البكتيرية ، إلا أن ترقيع فيروسات الثدييات أكثر تعقيدا ويستغرق وقتا طويلا. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تعمل بشكل موثوق للعمل المنتظم مع فيروسات الهربس البسيط.

Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

يساعد البروتوكول الطلاب على تحديد العدوى الفردية بوضوح وإجراء الفحص بسهولة ، مما يجعله أكثر كفاءة لتحديد العيار الفيروسي. يتضمن هذا البروتوكول إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على دقة وفعالية العلاجات المضادة للفيروسات ضد الأمراض.العقبات الأكثر صعوبة في بروتوكول الترقيم هذا هي عدد الخلايا لألواح البذر ، مع التأكد من أن الخلايا لا تكتظ أو تجف أو تتعرض للخدش طوال العملية. وقد يجد المرء أيضا صعوبة في الطبيعة الدقيقة العامة لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن الممارسة هي مساهم رئيسي في نجاح هذه التجربة.للبدء ، أكمل تخفيف العينة في إضافة الفيروس إلى الخلايا في جلسة مختبر واحدة. تمييع كل عينة فيروس يتم تجميعها في PBS بشكل متسلسل. عادة ما تستخدم تخفيفات 10 أضعاف للتتبع الأكثر دقة.احتفظ بجميع التخفيفات الفيروسية على الجليد حتى تصبح جاهزة لإضافة عينات الفيروسات المخففة هذه إلى الخلايا. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من بئر أو بئرين باستخدام ماصة. أضف بعناية عينة الفيروس المخفف قطرة إلى كل طبقة أحادية من الخلايا بقطرة من خلال جانب كل بئر.كرر العملية لكل بئر أو بئرين حتى تمتلئ اللوحة بأكملها بعينات الفيروس التي يتم لوحاتها. هز بلطف اللوحة بأكملها باليد. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بامتزاز الفيروس.بعد كل 10 دقائق ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وهزها بلطف مرة أخرى لنشر الفيروس بالتساوي عبر كل بئر ، ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة. لتقليل إمكانية حساب اللقاح غير الممتص عن غير قصد ، قم بإزالة عينة الفيروس من الآبار باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر وتخلص من العينة في كوب نفايات. ضع 2.5 ملليلتر من تراكب ميثيل سليلوز على اللوحة ، وضعه مرة أخرى في الحاضنة.قم بتطهير كوب النفايات، عادة مع إضافة المبيض أو اليودوفور أو فيروسيد مماثل، قبل إزالته من خزانة السلامة الأحيائية. بعد الحضانة لمدة يومين ، قم بإزالة تراكب ميثيل سليلوز من بئر أو بئرين في وقت واحد باستخدام ماصة ، وضعه في وعاء نفايات. أضف ما يقرب من ملليلترين من 1٪ من البنفسج البلوري في 50٪ من الإيثانول إلى كل بئر.احتضن الطبق مع جميع الآبار المملوءة بالبقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، قم بتطهير كأس النفايات كما هو موضح سابقا. اغسل الأطباق بقوة بماء الصنبور حتى يصبح الجريان السطحي واضحا.تأكد من وجود اختلافات تقارب 10 أضعاف في عدد اللويحات عبر كل سلسلة تخفيف. يصور الشكل انخفاضا بمقدار 10 أضعاف في عدد اللويحات حيث انخفض العدد القابل للعد من اللويحات في نطاق 10 إلى ناقص أربعة لجميع النسخ المتماثلة الثلاثة. الصور الثلاث الأولى في الشكل تصور لوحات في 10 إلى ناقص ثلاثة تخفيف.ومع ذلك ، يعرض الصف السفلي النتائج عندما لا يتم إجراء فحص البلاك بشكل جيد. هناك عدد قليل جدا من اللويحات المرئية من أي تخفيف في المناطق المرئية حول الجزء العلوي حيث رفعت خلايا Vero بالكامل من الركيزة. وبالمثل ، يوضح هذا الشكل مشاكل في جفاف الخلايا أو سوء التعامل معها أثناء فحص اللويحات.ومع ذلك ، فإن هذا الرقم يظهر بشكل نقدي ضعف بذر خلايا فيرو. يظهر كل بئر بقع أرجوانية داكنة ، مما يدل على أن الخلايا لا تنتشر بشكل جيد عبر البئر وتتراكم فوق بعضها البعض في مجموعات. للحصول على أفضل النتائج ، تأكد من انتشار الفيروس بشكل موحد عبر اللوحة لتجنب تكتل اللويحات تعتبر اختبارات اللويحات أكثر فعالية من الطرق الكمية الأخرى لأنها تحسب فقط الفيروس الحي.وبهذه الطريقة، يمكن إثبات فعالية حقيقية مضادة للفيروسات. بالإضافة إلى ذلك ، سمحت لنا هذه التقنية بتحديد الوجود الفيروسي على البؤر واستكشاف فعالية توصيل الأدوية من الأجهزة الطبية الجديدة في قطاعنا لأبحاث فيروس الهربس.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

سرعة الكشف الجزيئي والتمايز من فيروسات الأنفلونزا A و B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...