Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Vi takker utallige studerende i vores laboratorier (PJD og BJM), der har arbejdet sammen med os gennem årene med at forfine disse metoder. En særlig tak til Stan Person, under hvis vejledning denne metode først blev udviklet. Dette arbejde blev delvist støttet af Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund og NIGMS Bridges til Baccalaureate grant 5R25GM058264. Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences.

Alle procedurer med Vero-cellerne og levende herpesvirus er blevet godkendt af Towson University Institutional Biosafety Committee. En generaliseret ordning for disse procedurer er repræsenteret i figur 1.
1. Såning af Vero-cellerne
<ol><li>Dagen før påbegyndelse af plaque-analysen trypsiniseres Vero-celler og resuspend dem i almindelig Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) og supplerer i henhold til standard cellekultur...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Mens plaque-assays er næsten lige så gamle som selve pattedyrcellekulturen, ser det ud til, at hvert laboratorium har sit eget sæt protokoller til at udføre dette grundlæggende assay5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 </...

Begyndelsen på virusplaque-assays går tilbage til de første opdagelser af vira i 1890'erne1. Tobaksmosaikvirus blev først isoleret og videregivet tobaksblade, hvor individuelle infektionspletter kunne genkendes og kvantificeres som hidrørende fra en enkelt, levende virusenhed2, der senere blev identificeret som en virion2. Senere skelsættende undersøgelser med bakterier og bakteriofager perfektionerede de teknikker, der blev brugt til at plaque disse vira, herunder bakterier i midten af vækstfasen, seriel fortynding af bakteriofagprøver og topagar med efterfølgende visualisering af bogstavelige huller (navngivne plaques) i bakterieplænen3.
Plaquing af dyrevirus forsinkede den spændende forskning, der blev udført med bakteriofager, hovedsageligt fordi de metoder, der kræves til dyrkning af pattedyrceller i kultur, først blev udviklet i 1940'erne4. Fremkomsten af voksende murineceller i fravær af hele værtsorganismen4 skabte imidlertid en ny æra i evnen til at dyrke og tælle vira. Et sådant arbejde blev udvidet til formering og kvantation af Western Equine Encephalomyelitis virus i kyllingeceller og poliovirus i humane celler5,6. Efterhånden som området for dyrkelige pattedyrceller udvidede sig, gav de forskellige værtscellers væld af forskellige virusinfektioner verden et overflødighedshorn af muligheder for at studere alle mulige vira7. Dette omfattede udbredelse og kvantificering af humane herpesvirus, især herpes simplex virus-1 (HSV-1) og -2 (HSV-2), som forårsager mucokutane læsioner8. Det er vigtigt, at alle plaque-assays er afhængige af eksistensen af levende virioner, som kan komme ind i værtsceller på en receptormedieret måde i en prøve9. Uanset den allestedsnærværende og mangfoldighed af publikationer om udførelse af plaque assays5,10,11,12,13,14,15,16 er disse metoder til HSV-1/-2 en blanding af både kunst og videnskab; man kan ikke udføre analysen uden behørig opmærksomhed på alle detaljer i protokollen, og man kan heller ikke udføre et vellykket assay uden et krtitisk øje for subtilitet i processen. Dette manuskript skildrer en af de mest konsekvent reproducerbare metoder til HSV-1/-2 plaque assays, med præcise detaljer mod assayets kunst, der sjældent diskuteres.
Denne nuværende protokol opnår levende plakdannende enheder (PFU) tæller pålideligt for HSV-1 og -2. De bedste resultater opnås ved anvendelse af Vero-celler (transformerede afrikanske grønne abenyrepitelceller) ved lav passage (under passage nummer 155) og rutinemæssigt dyrket i alfa-MEM17 suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), L-alanyl-L-glutamin og en antibiotikum/antimykotisk blanding18. Vero-celler formeres normalt i dette medium to til tre gange om ugen ved en 1/5 fortynding hver gang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Der er adskillige offentliggjorte protokoller til plaquing af vira, herunder referencer inden for primær litteratur til metodologi. Imidlertid kan plaquing vira være vanskelige at udføre, hvilket kræver fokus på dets specifikationer og forfining. Det er en utrolig udfordrende metode for nye studerende at mestre, hovedsageligt fordi det kræver omhyggelig opmærksomhed på de mest minutiøse detaljer. Denne demonstration af plaquing herpes simplex vira bør hjælpe dem, der har kæmpet med at visualisere metoden, især dens nuancer, gennem årene. Selv om dette manuskript er baseret på de samme principper for standardplaquing-metoden, adskiller det sig ved, at det indeholder en detaljeret beskrivelse af (1) hvordan man bedst håndterer værtsceller for at undgå forstyrrelser under processen, (2) et mere nyttigt viskøst medium end agarose for at begrænse diffusionen af virioner og (3) en simpel fikserings- og farvningsprocedure, der giver pålideligt reproducerbare resultater. Desuden hjælper den ledsagende video med at demonstrere de finere sondringer i processen, som ofte savnes, når man instruerer andre om at udføre plaque-assays.

Tabel 1 viser et eksperiment, der har optimale resultater. Alle 10 gange fortyndinger følger et ca. 10 gange fald i antallet af plak. Denne slags data kan også ses i figur 2, et egentligt plaque assay, hvor det tællelige antal plaques faldt i intervallet 10-4 for alle tre replikater. Det samme kan ses i figur 3, den øverste række, hvor det tællelige antal plaketter var i 10-3 fortyndingen.
...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing er en rutinemæssig metode, der bruges til at kvantificere levende vira i en befolkning. Selvom plaquing ofte undervises i forskellige mikrobiologiske læseplaner med bakterier og bakteriofager, er plaquing af pattedyrvirus mere kompleks og tidskrævende. Denne protokol beskriver de procedurer, der fungerer pålideligt til regelmæssigt arbejde med herpes simplex-vira.

Plaquing af herpes Simplex vira

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokollen hjælper eleverne med at identificere individuelle infektioner tydeligt og udføre assayet let, hvilket gør det mere effektivt at kvantificere viral titer. Denne protokol indeholder en simpel fikserings- og farvningsprocedure, der giver pålidelige og reproducerbare resultater. Denne metode kan give indsigt i nøjagtigheden og effektiviteten af antivirale behandlinger mod sygdomme.De vanskeligere forhindringer i denne plaquing-protokol er celletællingerne for såningsplader, og sørg for, at cellerne ikke overfylder, tørrer ud eller bliver ridset gennem hele processen. Man kan også finde vanskeligheder i den overordnede omhyggelige karakter af denne protokol. Praksis er imidlertid en stor bidragyder til succesen med dette eksperiment.Til at begynde med skal du afslutte prøvefortyndingen ved tilsætning af virus til celler i en laboratoriesession. Fortynd serielt hver virusprøve, der plaques i PBS. Brug typisk 10 gange fortyndinger til mest præcis sporing.Opbevar alle virale fortyndinger på is, indtil de er klar til at tilføje disse fortyndede virusprøver til cellerne. Fjern cellekulturmediet fra en eller to brønde ved hjælp af en pipette. Tilsæt forsigtigt den fortyndede virusprøve dråbevis til hvert monolag af celler dråbevis gennem siden af hver brønd.Gentag processen for hver eller to brønde, indtil hele pladen er fyldt med virusprøverne, der plaques. Rock forsigtigt hele pladen i hånden. Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius i en time for at tillade virusadsorptionen.Efter hvert 10. minut skal du fjerne pladen fra inkubatoren, forsigtigt rocke den igen for at sprede viruset mere jævnt over hver brønd og derefter placere den tilbage i inkubatoren. For at mindske muligheden for utilsigtet at tælle uabsorberet inokulum skal virusprøven fjernes fra brøndene ved hjælp af en pipettespids på 1000 mikroliter og kasseres i et affaldsbægerglas. Anbring 2,5 ml et methylcelluloseoverlay på pladen, og læg det tilbage i inkubatoren.Desinficere affaldsbægerglasset, typisk med tilsætning af blegemiddel, en iodphor eller et lignende virucid, inden det fjernes fra biosikkerhedsskabet. Efter to-dages inkubation fjernes methylcelluloseoverlejringen fra en eller to brønde ad gangen ved hjælp af en pipette og anbringes i et affaldsbægerglas. Tilsæt ca. to milliliter 1% krystalviolet i 50% ethanol til hver brønd.Inkuber pladen med alle brønde fyldt med pletten i 30 minutter ved 37 grader Celsius. På dette tidspunkt desinficeres affalds bægerglasset som påvist tidligere. Vask pladerne kraftigt med ledningsvand, indtil afstrømningen er klar.Sørg for, at der er ca. 10 gange forskelle i antallet af plaques på tværs af hver fortyndingsserie. Figuren viser et 10 gange fald i antallet af plaketter, hvor det tællelige antal plaketter faldt i intervallet 10 til minus fire for alle tre replikater. De første tre billeder i figuren viser plaques i 10 til minus tre fortynding.Den nederste række viser dog resultater, når et plaque-assay ikke udføres godt. Der er meget få plaques synlige fra enhver fortynding i de synlige områder omkring toppen, hvor Vero-cellerne helt er løftet fra substratet. Tilsvarende viser denne figur problemer med celler, der tørrer ud eller forkert håndtering under plakanalysen.Denne figur viser imidlertid kritisk dårlig Vero-cellesåning. Hver brønd viser mørkere lilla pletter, hvilket indikerer, at celler ikke spredes godt over brønden og stablet oven på hinanden i klynger. For de bedste resultater skal du sørge for, at virussen spredes ensartet over pladen for at undgå klumpede plaques Plaque-assays er mere effektive end andre kvantitative metoder, fordi det kun tæller levende virus.På den måde kan ægte antiviral effekt etableres. Derudover har denne teknik gjort det muligt for os at kvantificere viral tilstedeværelse på fomitter og undersøge effektiviteten af lægemiddellevering fra nyt medicinsk udstyr inden for vores sektor af herpesvirusforskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Vira til kvantificering Viral Funktion på alle stadier af genekspression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Growth Konkurrence Assay til Bestemmelse af Replication Fitness af Human Immunodeficiency Virus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hurtig Molekylær Detection og Differentiering af Influenza Virus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...