Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

We bedanken talloze studenten in onze laboratoria (PJD en BJM) die in de loop der jaren met ons hebben samengewerkt om deze methoden te verfijnen. Een speciale dank aan Stan Person, onder wiens voogdij deze methodologie voor het eerst werd ontwikkeld. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund en NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health.

Alle procedures met de Vero-cellen en levende herpesvirussen zijn goedgekeurd door het Towson University Institutional Biosafety Committee. Een algemeen schema van deze procedures is weergegeven in figuur 1.
1. Zaaien van de Vero-cellen
<ol><li>De dag voordat de plaquetest wordt gestart, trypsiniseren Vero-cellen en resuspenderen ze in reguliere Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) en supplement volgens de standaard celkweekmethodologie19.<s...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Hoewel plaque-assays bijna net zo oud zijn als zoogdiercelkweek zelf, lijkt het erop dat elk laboratorium zijn eigen set protocollen heeft om deze basistest uit te voeren5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup class="xr...

Het begin van virus plaque assays gaan terug tot de eerste ontdekkingen van virussen in de jaren 18901. Tabaksmozaïekvirus werd voor het eerst geïsoleerd en doorgegeven op tabaksbladeren, waar individuele infectieplekken konden worden herkend en gekwantificeerd als afkomstig van een enkele, levende virusentiteit2, later geïdentificeerd als een virion2. Latere baanbrekende studies met bacteriën en bacteriofagen perfectioneerden de technieken die werden gebruikt om deze virussen te plaqueren, waaronder bacteriën in de mid-log fase van groei, seriële verdunning van bacteriofaagmonsters en top agar met daaropvolgende visualisatie van letterlijke gaten (plaques genoemd) in het bacteriële gazon3.
Plaquing van dierlijke virussen bleef achter bij het opwindende onderzoek dat werd uitgevoerd met bacteriofagen, vooral omdat de methoden die nodig zijn voor het kweken van zoogdiercellen in cultuur pas in de jaren 19404 werden ontwikkeld. De komst van groeiende muizencellen in afwezigheid van het hele gastheerorganisme4 bracht echter een nieuw tijdperk voort in het vermogen om virussen te kweken en te tellen. Dergelijk werk werd uitgebreid voor de verspreiding en kwantificering van western equine encefalomyelitisvirus in kippencellen en poliovirus in menselijke cellen5,6. Naarmate het rijk van kweekbare zoogdiercellen zich uitbreidde, gaf de schare van verschillende gastheercellen voor verschillende virale infecties de wereld een overvloed aan mogelijkheden om allerlei soorten virussen te bestuderen7. Dit omvatte de verspreiding en kwantificering van menselijke herpesvirussen, met name herpes simplex virus-1 (HSV-1) en -2 (HSV-2), die mucocutane laesies veroorzaken8. Belangrijk is dat alle plaque-assays afhankelijk zijn van het bestaan van levende virionen, die gastheercellen op een receptorgemedieerde manier in een monster kunnen binnendringen9. Ongeacht de alomtegenwoordigheid en veelheid aan publicaties over de uitvoering van plaque-assays5,10,11,12,13,14,15,16, zijn deze methoden voor HSV-1/-2 een mix van zowel kunst als wetenschap; men kan de test niet uitvoeren zonder de juiste aandacht voor elk detail in het protocol, noch kan men een succesvolle test uitvoeren zonder een kritisch oog voor subtiliteit in het proces. Dit manuscript toont een van de meest consistent reproduceerbare methoden voor HSV-1 /-2 plaque-assays, met nauwkeurige details over de kunst van de assay die zelden worden besproken.
Dit huidige protocol verkrijgt op betrouwbare wijze live plaquevormende eenheden (PFU) tellingen voor HSV-1 en -2. De beste resultaten worden verkregen met behulp van Vero-cellen (getransformeerde Afrikaanse groene apennierepitheelcellen) bij lage passage (onder passagenummer 155) en routinematig gekweekt in alfa-MEM17 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), L-alanyl-L-glutamine en een antibioticum / antimycotisch mengsel18. Vero-cellen worden standaard twee tot drie keer per week in dit medium vermeerderd bij een verdunning van 1/5 telkens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Er zijn tal van gepubliceerde protocollen voor het plaquen van virussen, inclusief verwijzingen in de primaire literatuur voor methodologie. Het paaien van virussen kan echter moeilijk uit te voeren zijn, waardoor de nadruk moet worden gelegd op de specificaties en verfijning ervan. Het is een ongelooflijk uitdagende methode voor nieuwe studenten om onder de knie te krijgen, vooral omdat het nauwgezette aandacht vereist voor de meest minuscule details. Deze demonstratie van het plaquen van herpes simplex-virussen zou degenen moeten helpen die in de loop der jaren hebben geworsteld met het visualiseren van de methode, vooral de nuances ervan. Hoewel dit manuscript is gebaseerd op dezelfde principes van de standaard plaquing-methodologie, verschilt het in die zin dat het een gedetailleerde beschrijving bevat van (1) hoe gastheercellen het beste kunnen worden behandeld om verstoring tijdens het proces te voorkomen, (2) een nuttiger viskeus medium dan agarose om de diffusie van virionen te beperken, en (3) een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbaar reproduceerbare resultaten oplevert. Bovendien helpt de bijbehorende video de fijnere onderscheidingen in het proces te demonstreren, die vaak worden gemist bij het instrueren van anderen over het uitvoeren van plaque-assays.

Tabel 1 toont een experiment dat optimale resultaten heeft. Alle 10-voudige verdunningen volgen op een ongeveer 10-voudige afname van het aantal plaques. Dit soort gegevens zijn ook te zien in figuur 2, een werkelijke plaquetest waarbij het telbare aantal plaques in het bereik van 10-4 viel voor alle drie de replicaties. Hetzelfde is te zien in figuur 3, de bovenste rij, waar het telbare aantal plaques zich in de 10-3 verdunning<...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.

Plaquing van Herpes Simplex Virussen

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Het protocol helpt de studenten individuele infecties duidelijk te identificeren en de test gemakkelijk uit te voeren, waardoor het efficiënter wordt om virale titer te kwantificeren. Dit protocol bevat een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbare en reproduceerbare resultaten oplevert. Deze methode kan inzicht geven in de nauwkeurigheid en effectiviteit van antivirale behandelingen tegen ziekten.De moeilijkere hindernissen van dit plaquingprotocol zijn de celtellingen voor zaaiplaten, die ervoor zorgen dat de cellen niet overvol raken, uitdrogen of krassen krijgen tijdens het proces. Men kan ook moeilijkheden ondervinden bij de algehele nauwgezetheid van dit protocol. De praktijk levert echter een belangrijke bijdrage aan het succes van dit experiment.Voltooi om te beginnen de monsterverdunning in de toevoeging van virus aan cellen in één laboratoriumsessie. Verdun elk virusmonster dat in PBS wordt geplakt serieel. Gebruik meestal 10-voudige verdunningen voor de meest nauwkeurige tracking.Bewaar alle virale verdunningen op ijs totdat ze klaar zijn om deze verdunde virusmonsters aan de cellen toe te voegen. Verwijder het celkweekmedium uit een of twee putjes met een pipet. Voeg het verdunde virusmonster voorzichtig druppelsgewijs toe aan elke monolaag cellen druppelsgewijs door de zijkant van elke put.Herhaal het proces voor elke één of twee putten totdat de hele plaat is gevuld met de virusmonsters die worden geplakt. Wieg het hele bord voorzichtig met de hand. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius gedurende een uur om de virusadsorptie mogelijk te maken.Verwijder na elke 10 minuten de plaat uit de couveuse, schommel hem voorzichtig opnieuw om het virus gelijkmatiger over elke put te verspreiden en plaats hem vervolgens terug in de couveuse. Om de mogelijkheid te verkleinen dat niet-geabsorbeerd entmateriaal per ongeluk wordt geteld, verwijdert u het virusmonster uit de putten met behulp van een pipetpunt van 1000 microliter en gooit u het monster weg in een afvalbeker. Plaats 2,5 milliliter van een methylcellulose-overlay op de plaat en plaats deze terug in de incubator.Desinfecteer het afvalbeker, meestal met de toevoeging van bleekmiddel, een jodofor of een vergelijkbaar virucide, voordat u het uit de bioveiligheidskast verwijdert. Verwijder na de incubatietijd van twee dagen de methylcellulose-overlay uit een of twee putten tegelijk met behulp van een pipet en plaats deze in een afvalbeker. Voeg ongeveer twee milliliter 1% kristalviolet in 50% ethanol toe aan elke put.Incubeer de plaat met alle putjes gevuld met de vlek gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Desinfecteer op dit punt het afvalbeker zoals eerder aangetoond. Was de borden krachtig met kraanwater totdat de afvoer helder is.Zorg ervoor dat er ongeveer 10-voudige verschillen zijn in het aantal plaques in elke verdunningsreeks. De figuur toont een 10-voudige afname van plaquetellingen waarbij het telbare aantal plaques daalde in het bereik van 10 tot min vier voor alle drie de replicaties. De eerste drie afbeeldingen in de figuur tonen plaquettes in de verdunning van 10 tot min drie.De onderste rij toont echter resultaten wanneer een plaquetest niet goed wordt uitgevoerd. Er zijn zeer weinig plaques zichtbaar van enige verdunning in de zichtbare gebieden rond de bovenkant waar de Vero-cellen volledig uit het substraat zijn opgetild. Evenzo toont deze figuur problemen met cellen die uitdrogen of verkeerd worden behandeld tijdens de plaquetest.Dit cijfer toont echter kritisch slechte Vero-celzaaiing. Elke put vertoont donkerdere paarse vlekken, wat wijst op cellen die zich niet goed over de put verspreiden en in clusters op elkaar zijn gestapeld. Voor de beste resultaten, zorg ervoor dat het virus gelijkmatig over de plaat wordt verspreid om samengeklonterde plaques te voorkomen Plaque-assays zijn effectiever dan andere kwantitatieve methoden omdat het alleen levend virus telt.Op die manier kan een echte antivirale werkzaamheid worden vastgesteld. Bovendien heeft deze techniek ons in staat gesteld om de virale aanwezigheid op fomites te kwantificeren en de effectiviteit van medicijnafgifte van nieuwe medische hulpmiddelen binnen onze sector van herpesvirusonderzoek te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snelle Moleculaire detectie en differentiatie influenzavirussen A en B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie