Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Wir danken unzähligen Studenten in unseren Laboren (PJD und BJM), die im Laufe der Jahre mit uns zusammengearbeitet haben, um diese Methoden zu verfeinern. Ein besonderer Dank geht an Stan Person, unter dessen Anleitung diese Methodik zuerst entwickelt wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund und NIGMS Bridges to the Baccalaureate Grant 5R25GM058264 unterstützt. Dieser Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health dar.

Alle Verfahren mit den Vero-Zellen und lebenden Herpesviren wurden vom Towson University Institutional Biosafety Committee genehmigt. Ein verallgemeinertes Schema dieser Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Aussaat der Vero-Zellen
<ol><li>Trypsinisieren Sie am Tag vor Beginn des Plaque-Assays Vero-Zellen und resuspendieren Sie sie in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) und ergänzen Sie sie gemäß der Standard-Zellkulturmethodik19<s...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. 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M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Während Plaque-Assays fast so alt sind wie die Zellkultur von Säugetieren selbst, scheint es, dass jedes Labor seine eigenen Protokolle hat, um diesen grundlegenden Assay auszuführen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 </su...

Die Anfänge der Virus-Plaque-Assays gehen auf die ersten Entdeckungen von Viren in den 1890er Jahren zurück1. Das Tabakmosaikvirus wurde zunächst isoliert und auf Tabakblättern weitergegeben, wo einzelne Infektionsflecken erkannt und quantifiziert werden konnten, die von einer einzigen, lebenden Virusentität stammten2, die später als Virion identifiziert wurde2. Spätere bahnbrechende Studien mit Bakterien und Bakteriophagen perfektionierten die Techniken, die verwendet wurden, um diese Viren zu beflecken, einschließlich Bakterien in der Mid-Log-Phase des Wachstums, serielle Verdünnung von Bakteriophagenproben und Top-Agar mit anschließender Visualisierung von buchstäblichen Löchern (benannte Plaques) im Bakterienrasen3.
Das Plaquieren von Tierviren hinkte der spannenden Forschung mit Bakteriophagen hinterher, vor allem, weil die Methoden, die für die Züchtung von Säugetierzellen in Kultur erforderlich sind, erst in den 1940er Jahren entwickelt wurden4. Das Aufkommen von wachsenden murinen Zellen in Abwesenheit des gesamten Wirtsorganismus4 brachte jedoch eine neue Ära in der Fähigkeit hervor, Viren zu kultivieren und zu zählen. Diese Arbeiten wurden für die Vermehrung und Quantifizierung des Western Equine Encephalomyelitis-Virus in Hühnerzellen und des Poliovirus in menschlichen Zellen erweitert5,6. Als sich der Bereich der kultivierbaren Säugetierzellen ausdehnte, gab die Schar verschiedener Wirtszellen für verschiedene Virusinfektionen der Welt ein Füllhorn von Möglichkeiten, alle Arten von Viren zu untersuchen7. Dazu gehörte die Vermehrung und Quantifizierung von humanen Herpesviren, insbesondere Herpes-simplex-Viren-1 (HSV-1) und -2 (HSV-2), die mukokutane Läsionen verursachen8. Wichtig ist, dass alle Plaque-Assays von der Existenz lebender Virionen abhängig sind, die in einer Probe rezeptorvermittelt in Wirtszellen eindringen können9. Unabhängig von der Allgegenwart und Vielzahl von Publikationen zur Durchführung von Plaque-Assays5,10,11,12,13,14,15,16 sind diese Methoden für HSV-1/-2 eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft; Man kann den Assay nicht ohne angemessene Aufmerksamkeit für jedes Detail im Protokoll durchführen, noch kann man einen erfolgreichen Assay ohne ein kritisches Auge für Subtilität im Prozess durchführen. Dieses Manuskript zeigt eine der konsistentesten reproduzierbaren Methoden für HSV-1/-2-Plaque-Assays, mit präzisen Details zur Kunst des Assays, die selten diskutiert werden.
Dieses aktuelle Protokoll erhält zuverlässig lebende plaquebildende Einheiten (PFU) für HSV-1 und -2. Die besten Ergebnisse werden unter Verwendung von Vero-Zellen (transformierte Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen) bei niedriger Passage (unter Passage Nummer 155) erzielt und routinemäßig in alpha-MEM17 gezüchtet, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), L-Alanyl-L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen Mischung18. Vero-Zellen werden in diesem Medium standardmäßig zwei- bis dreimal pro Woche mit einer 1/5-Verdünnung jedes Mal vermehrt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Es gibt zahlreiche veröffentlichte Protokolle für das Plaquieren von Viren, einschließlich Referenzen in der Primärliteratur für die Methodik. Das Plaquieren von Viren kann jedoch schwierig durchzuführen sein, da es erforderlich ist, sich auf seine Spezifikationen und Verfeinerung zu konzentrieren. Es ist eine unglaublich herausfordernde Methode für neue Schüler, vor allem, weil sie akribische Aufmerksamkeit für die kleinsten Details erfordert. Diese Demonstration des Plaquing von Herpes-simplex-Viren sollte denjenigen helfen, die im Laufe der Jahre mit der Visualisierung der Methode, insbesondere ihrer Nuancen, zu kämpfen hatten. Während dieses Manuskript auf den gleichen Prinzipien der Standard-Plaquing-Methodik basiert, unterscheidet es sich dadurch, dass es eine detaillierte Beschreibung enthält, (1) wie Wirtszellen am besten gehandhabt werden, um Störungen während des Prozesses zu vermeiden, (2) ein nützlicheres viskoses Medium als Agarose, um die Diffusion von Virionen zu begrenzen, und (3) ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse liefert. Darüber hinaus hilft das begleitende Video, die feineren Unterscheidungen im Prozess zu demonstrieren, die häufig übersehen werden, wenn andere in die Durchführung von Plaque-Assays eingewiesen werden.

Tabelle 1 zeigt ein Experiment mit optimalen Ergebnissen. Alle 10-fachen Verdünnungen folgen einer etwa 10-fachen Abnahme der Plaquezahl. Diese Art von Daten ist auch in Abbildung 2 zu sehen, einem tatsächlichen Plaque-Assay, bei dem die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate im Bereich von 10-4 lag. Dasselbe ist in Abbildung 3, der obersten Reihe, zu sehen, wo die abzählbare Anzahl von Plaques in der 10-3-Verdünnung war.<strong cla...

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Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing ist eine Routinemethode zur Quantifizierung lebender Viren in einer Population. Obwohl Plaquing häufig in verschiedenen mikrobiologischen Lehrplänen mit Bakterien und Bakteriophagen gelehrt wird, ist das Plaquieren von Säugetierviren komplexer und zeitaufwendiger. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, die für die regelmäßige Arbeit mit Herpes-simplex-Viren zuverlässig funktionieren.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Das Protokoll hilft den Schülern, einzelne Infektionen klar zu identifizieren und den Assay einfach durchzuführen, wodurch es effizienter wird, den viralen Titer zu quantifizieren. Dieses Protokoll beinhaltet ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Diese Methode kann einen Einblick in die Genauigkeit und Wirksamkeit antiviraler Behandlungen gegen Krankheiten geben.Die schwierigeren Hürden dieses Plaquing-Protokolls sind die Zellzahlen für die Aussaatplatten, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Prozesses nicht überfüllt, austrocknen oder zerkratzt werden. Man kann auch Schwierigkeiten in der insgesamt akribischen Natur dieses Protokolls haben. Die Praxis trägt jedoch wesentlich zum Erfolg dieses Experiments bei.Schließen Sie zunächst die Probenverdünnung unter Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab. Verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, die in PBS plaquet wird. Verwenden Sie in der Regel 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis, bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen. Entfernen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen. Fügen Sie die verdünnte Virusprobe tropfenweise zu jeder Monoschicht von Zellen tropfenweise durch die Seite jedes Brunnens hinzu.Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind. Den gesamten Teller vorsichtig von Hand schaukeln. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Virusadsorption zu ermöglichen.Entfernen Sie alle 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig wieder, um das Virus gleichmäßiger über jedes Bohrloch zu verteilen, und legen Sie es dann wieder in den Inkubator. Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze aus den Vertiefungen und entsorgen Sie die Probe in einem Abfallbecherglas. Legen Sie 2,5 Milliliter eines Methylcellulose-Overlays auf die Platte und legen Sie es wieder in den Inkubator.Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen. Entfernen Sie nach der zweitägigen Inkubation das Methylcellulose-Overlay mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen gleichzeitig und legen Sie es in ein Abfallbecherglas. Fügen Sie etwa zwei Milliliter 1% Kristallviolett in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu.Inkubieren Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.Stellen Sie sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt. Die Abbildung zeigt eine 10-fache Abnahme der Plaque-Anzahl, wobei die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate in den Bereich von 10 bis minus vier fiel. Die ersten drei Bilder in der Abbildung zeigen Tafeln in der 10 bis minus drei Verdünnung.Die untere Reihe zeigt jedoch Ergebnisse, wenn ein Plaque-Assay nicht gut durchgeführt wird. Es gibt nur sehr wenige Plaques, die von einer Verdünnung in den sichtbaren Bereichen um die Oberseite sichtbar sind, wo die Vero-Zellen vollständig vom Substrat abgehoben wurden. In ähnlicher Weise zeigt diese Abbildung Probleme mit dem Austrocknen von Zellen oder der falschen Handhabung während des Plaque-Assays.Diese Zahl zeigt jedoch kritisch eine schlechte Vero-Zellaussaat. Jeder Brunnen zeigt dunklere violette Flecken, die auf Zellen hinweisen, die sich nicht gut über den Brunnen ausbreiten und in Clustern übereinander gestapelt sind. Für beste Ergebnisse stellen Sie sicher, dass das Virus gleichmäßig über die Platte verteilt wird, um verklumpte Plaque-Assays zu vermeiden. Plaque-Assays sind effektiver als andere quantitative Methoden, da sie nur lebende Viren zählen.Auf diese Weise kann eine echte antivirale Wirksamkeit festgestellt werden. Darüber hinaus hat uns diese Technik ermöglicht, die virale Präsenz auf Fomiten zu quantifizieren und die Wirksamkeit der Arzneimittelabgabe von neuartigen Medizinprodukten in unserem Bereich der Herpesvirusforschung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...