Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

אנו מודים לאינספור סטודנטים במעבדות שלנו (PJD ו- BJM) שעבדו איתנו לאורך השנים בשיפור שיטות אלה. תודה מיוחדת לסטן פרסון, שתחת חסותו פותחה לראשונה מתודולוגיה זו. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי אוניברסיטת טוסון פישר המכללה למדע ומתמטיקה תואר ראשון מחקר תמיכה קרן וגשרים NIGMS למענק Baccalaureate 5R25GM058264. תוכן זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות.

כל ההליכים עם תאי Vero והרפסוירוסים חיים אושרו על ידי ועדת הביו-בטיחות המוסדית של אוניברסיטת טוסון. ערכה כללית של הליכים אלה מיוצגת באיור 1.
1. זריעת תאי Vero
<ol><li>יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינציה תאי Vero resuspened אותם רגילים של Dulbecco שונה נשרים בינוני (D...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

בעוד שבדיקות פלאק ישנות כמעט כמו תרבות התאים של היונקים עצמה, נראה שלכל מעבדה יש מערכת פרוטוקולים משלה לביצוע בדיקה בסיסית זו5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<s...

ראשיתם של בדיקות פלאק וירוס לחזור לתגליות הראשונות של וירוסים בשנות ה -18901. נגיף פסיפס הטבק היה מבודד לראשונה והועבר על עלי טבק, שם ניתן לזהות ולכמת כתמי זיהום בודדים שמקורם בישות וירוס חיה אחת2, שזוהתה מאוחר יותר כ- virion2. מחקרים ראשוניים מאוחרים יותר עם חיידקים ובקטריופאג'ים שיכללו את הטכניקות המשמשות לפלייק של וירוסים אלה, כולל חיידקים בשלב אמצע היומן של הצמיחה, דילול סדרתי של דגימות בקטריופאג ', ואגר העליון עם הדמיה מאוחרת יותר של חורים מילוליים (הנקראים פלאקים) במדשאה החיידקית3.
הפלקה של וירוסים מן החי פיגרה במחקר המרגש שנערך עם בקטריופאג'ים, בעיקר משום שהשיטות הנדרשות לגידול תאי יונקים בתרבית לא פותחו עד שנות ה-40 של המאה ה-20. עם זאת, הופעתם של תאי מורין גדלים בהיעדר האורגניזם המארח כולו4 הולידה עידן חדש ביכולת לתרבות ולספור וירוסים. עבודה זו הורחבה עבור התפשטות וכמות של וירוס אנצפלומליטיס סוס מערבי בתאי עוף ופוליו וירוס בתאים אנושיים5,6. ככל שתחום תאי היונקים הפולחניים התרחב, החבורה של תאים מארחים שונים לזיהומים ויראליים שונים העניקה לעולם שפע של אפשרויות לחקור כל מיני וירוסים7. זה כלל את ההתפשטות והכימות של הרפס-וירוסים אנושיים, במיוחד וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) ו -2 (HSV-2), הגורמים נגעים mucocutaneous8. חשוב לציין, כל בדיקות הפלאק תלויות בקיומם של נגיפים חיים, שיכולים להיכנס לתאים מארחים באופן בתיווך קולטן במדגם9. ללא קשר בכל מקום ושפע של פרסומים על ביצוע בדיקות פלאק5,10,11,11,12,13,14,15,16, שיטות אלה עבור HSV-1/-2 הן תערובת של אמנות ומדע; אי אפשר לנהל את הבדיקה ללא תשומת לב ראויה לכל פרט בפרוטוקול, וגם לא ניתן לבצע בדיקה מוצלחת ללא עין קרטית לעידון בתהליך. כתב יד זה מתאר את אחת השיטות הניתנות לשחזור באופן עקבי ביותר עבור בדיקות פלאק HSV-1/-2, עם פרטים מדויקים כלפי אמנות הבדיקה שנדונים לעתים רחוקות.
פרוטוקול נוכחי זה מקבל ספירות יחידות יוצרות פלאק חי (PFU) עבור HSV-1 ו- -2 באופן אמין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תאי Vero (תאי אפיתל כליות קוף ירוק אפריקאי שעברו טרנספורמציה) במעבר נמוך (מתחת למעבר מספר 155) וגדלים באופן שגרתי באלפא-MEM17 בתוספת סרום עגל עוברי 10% (FCS), L-אלניל-L-גלוטמין, ותערובת אנטיביוטית/אנטי-מיקרוטית18. תאי Vero מופצים באופן סטנדרטי במדיום זה פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע בדילול של 1/5 בכל פעם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

ישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו עבור וירוסים plaquing, כולל הפניות בתוך הספרות הראשית למתודולוגיה. עם זאת, וירוסים plaquing יכול להיות קשה לביצוע, הדורשים התמקדות מפרטים שלה עידון. זוהי שיטה מאתגרת להפליא עבור תלמידים חדשים לשלוט, בעיקר משום שהיא דורשת תשומת לב קפדנית לפרטים הקטנים ביותר. הדגמה זו של וירוסים הרפס סימפלקס plaquing צריך לעזור לאלה שנאבקו עם לדמיין את השיטה, במיוחד הניואנסים שלה, לאורך השנים. בעוד שכתב יד זה מבוסס על אותם עקרונות של מתודולוגיית הפלקה הסטנדרטית, הוא שונה בכך שהוא מכיל תיאור מפורט של (1) כיצד לטפל בצורה הטובה ביותר בתאים מארחים כדי למנוע הפרעה במהלך התהליך, (2) מדיום צמיג שימושי יותר מאשר אגרוז כדי להגביל את פיזור הוויריונים, ו - (3) הליך קיבעון והכתמה פשוט המייצר תוצאות ניתנות לשחזור אמינות. יתר על כן, הסרטון המצורף מסייע להדגים את ההבחנות העדינות בתהליך, אשר לעתים קרובות חסרים כאשר מנחים אחרים על ביצוע בדיקות פלאק.

טבלה 1 מציגה ניסוי בעל תוצאות מיטביות. כל הדילולים פי 10 באים בעקבות ירידה של פי 10 בספירת הפלאק. נתונים מסוג זה ניתן לראות גם באיור 2, בדיקת פלאק בפועל שבה מספר הלוחות הניתן לספירה נפל בטווח של 10-4 עבור כל שלושת המשכפלים. אותו הדבר ניתן לראות באיור 3</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג'ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

הפרוטוקול מסייע לתלמידים לזהות זיהומים בודדים בבירור ולבצע את הבדיקה בקלות, מה שהופך אותו ליעיל יותר לכמת טיטר ויראלי. פרוטוקול זה משלב הליך קיבעון והכתמה פשוט המפיק תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הדיוק והיעילות של טיפולים אנטי-ויראליים נגד מחלות.המשוכות הקשות יותר של פרוטוקול הפלקה הזה הן ספירת התאים עבור זריעת לוחות, מוודאים שהתאים אינם צפופים, מתייבשים או נשרטים לאורך כל התהליך. אפשר גם למצוא קושי באופי הקפדני הכולל של פרוטוקול זה. עם זאת, בפועל הוא תורם מרכזי של ההצלחה של ניסוי זה.כדי להתחיל, להשלים את דילול המדגם בתוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד. לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב- PBS. בדרך כלל יש להשתמש בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.שמור את כל הדילולים הנגיפיים על הקרח עד שיהיה מוכן להוסיף את דגימות הנגיף המדוללות האלה לתאים. הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים באמצעות פיפטה. הוסף בזהירות את דגימת הווירוס המדוללת טיפה לכל חד שכבתי של תאים dropwise דרך הצד של כל באר.חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק. רוק בעדינות את הצלחת כולה ביד. ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לאפשר את ספיחת הנגיף.לאחר כל 10 דקות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור. כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג של inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות באמצעות קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר ולהשליך את המדגם בכוס פסולת. מניחים 2.5 מיליליטר של כיסוי מתילצלולוז על הצלחת, ומחזירים אותו לאינקובטור.לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית. לאחר הדגירה בת היומיים, הסירו את שכבת היתר של מתילצללוז מבאר אחת או שתיים בכל פעם באמצעות פיפטה, והניחו אותה בכוס פסולת. הוסף כשני מיליליטר של 1% סגול קריסטל ב 50% אתנול לכל באר.לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, לחטא את הפסולת כפי שהוכח בעבר. לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור.ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול. האיור מתאר ירידה של פי 10 בספירת הלוחות שבהם מספר הלוחות הניתן לספירה ירד בטווח של 10 עד מינוס 4 עבור כל שלושת המשכפלים. שלוש התמונות הראשונות באיור מתארות לוחות בדילול של 10 עד מינוס שלוש.עם זאת, השורה התחתונה מציגה תוצאות כאשר בדיקת פלאק אינה מתנהלת היטב. ישנם מעט מאוד לוחות הנראים מכל דילול באזורים הנראים לעין סביב החלק העליון שבו תאי Vero הוסרו לחלוטין מן המצע. באופן דומה, נתון זה מראה בעיות עם תאים מתייבשים או טיפול לקוי במהלך בדיקת פלאק.עם זאת, נתון זה מראה באופן ביקורתי זריעת תאי Vero עניים. כל באר מראה כתמים סגולים כהים יותר, המעידים על תאים שאינם מתפשטים היטב על פני הבאר ונערמו זה על גבי זה באשכולות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא שהנגיף מתפשט באופן אחיד על פני הצלחת כדי למנוע לוחות מגובשים בדיקות פלאק יעילים יותר מאשר שיטות כמותיות אחרות כי זה סופר רק וירוס חי.בדרך זו, יעילות אנטי ויראלית אמיתית ניתן לבסס. בנוסף, טכניקה זו אפשרה לנו לכמת נוכחות ויראלית על fomites ולחקור את האפקטיביות של אספקת תרופות ממכשירים רפואיים חדשניים בתוך המגזר שלנו של מחקר וירוס הרפס.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...