Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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우리는 이러한 방법을 다듬는 수년에 걸쳐 우리와 함께 일해 온 우리 연구소 (PJD 및 BJM)의 수많은 학생들에게 감사드립니다. 이 방법론이 처음 개발 된 스탠 페르소나 (Stan Person)에게 특별한 감사를드립니다. 이 작업은 Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support 기금과 NIGMS Bridges가 Baccalaureate 보조금 5R25GM058264에 부분적으로 지원했습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 국립 의학 연구소의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다.

Vero 세포 및 살아있는 헤르페스 바이러스에 대한 모든 절차는 Towson University Institutional Biosafety Committee의 승인을 받았습니다. 이러한 절차의 일반화된 체계는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 베로 세포의 시딩
<ol><li>플라크 분석을 시작하기 전날, 베로 세포를 트립신화하고 일반 둘베코의 변형 이글스 배지 (DMEM)에 재현탁시키고 표준 세포 배양 방...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. 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R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

플라크 분석은 포유류 세포 배양 자체만큼이나 오래되었지만, 각 실험실에는 이 기본 분석을 실행하기 위한 자체 프로토콜 세트가 있는 것으로 보입니다5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup class="xre...

바이러스 플라크 분석의 시작은 1890 년대 바이러스의 첫 번째 발견으로 돌아갑니다1. 담배 모자이크 바이러스는 먼저 분리되어 담배 잎에 전달되었으며, 개별 감염 지점은 단일 살아있는 바이러스 엔티티2에서 유래 한 것으로 인식되고 정량화 될 수 있었으며 나중에 virion2로 확인되었습니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 이후의 정액 연구는 성장의 중간 로그 단계의 박테리아, 박테리오파지 샘플의 연속 희석 및 박테리아 잔디밭의 문자 그대로의 구멍 (플라크로 명명 됨)의 후속 시각화를 통한 상단 한천을 포함하여 이러한 바이러스를 플라크하는 데 사용되는 기술을 완성했습니다3.
동물 바이러스의 플라쿼싱은 박테리오파지와 함께 수행되고 있는 흥미로운 연구가 지연되었는데, 그 이유는 주로 배양에서 포유동물 세포를 성장시키는 데 필요한 방법이 1940년대까지 개발되지 않았기 때문이다4. 그러나, 전체 숙주 유기체의 부재 하에 성장하는 뮤린 세포의 출현4은 바이러스를 배양하고 계수하는 능력의 새로운 시대를 열었다. 이러한 작업은 닭 세포에서 웨스턴 에퀸 뇌척수염 바이러스의 증식 및 정량화와 인간 세포에서의 폴리오바이러스5,6 동안 확장되었다. 배양 가능한 포유류 세포의 영역이 확장됨에 따라, 다양한 바이러스 감염에 대한 다양한 숙주 세포의 bevy는 모든 종류의 바이러스를 연구 할 수있는 가능성의 각막7을 세계에 주었다. 여기에는 인간 헤르페스바이러스, 특히 점막 피부 병변을 일으키는 단순 헤르페스 바이러스-1(HSV-1) 및 -2(HSV-2)의 전파 및 정량화가 포함되었다8. 중요하게도, 모든 플라크 검정은 살아있는 비리온의 존재에 의존하며, 이는 샘플9에서 수용체-매개된 방식으로 숙주 세포에 진입할 수 있다. 플라크 분석의 실행에 관한 편재성과 다수의 간행물에 관계없이5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2에 대한 이러한 방법은 예술과 과학의 혼합물이다; 프로토콜의 모든 세부 사항에 적절한주의를 기울이지 않고 분석을 수행 할 수 없으며 프로세스의 미묘함에 대한 비판적 인 눈없이 성공적인 분석을 수행 할 수도 없습니다. 이 원고는 HSV-1/-2 플라크 분석을위한 가장 일관되게 재현 가능한 방법 중 하나를 묘사하며, 거의 논의되지 않는 분석의 기술에 대한 정확한 세부 사항을 보여줍니다.
이 현재 프로토콜은 HSV-1 및 -2에 대한 살아있는 플라크 형성 단위 (PFU) 카운트를 안정적으로 얻습니다. 가장 좋은 결과는 낮은 계대 (통과 번호 155 이하)에서 Vero 세포 (형질전환 된 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포)를 사용하고 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), L-알라닐-L-글루타민 및 항생제 / 항균제 혼합물로 보충 된 알파 MEM17에서 일상적으로 성장합니다18. 베로 세포는 표준적으로 이 배지에서 매주 두세 번 1/5 희석으로 전파된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

방법론에 대한 기본 문헌 내의 참고 문헌을 포함하여 바이러스를 플라킹하기위한 수많은 출판 된 프로토콜이 있습니다. 그러나 플라킹 바이러스는 수행하기가 어려울 수 있으므로 사양과 개선에 중점을 두어야합니다. 신입생이 마스터하는 것은 매우 어려운 방법이며, 주로 가장 세심한주의를 기울여야하기 때문입니다. 단순 포진 바이러스를 괴롭히는 이러한 시연은 수년에 걸쳐이 방법, 특히 뉘앙스를 시각화하는 데 어려움을 겪은 사람들을 도울 것입니다. 이 원고는 표준 플라킹 방법론의 동일한 원칙에 기초하지만, (1) 공정 중 파괴를 피하기 위해 숙주 세포를 가장 잘 다루는 방법, (2) 비리온의 확산을 제한하기 위해 아가로스보다 더 유용한 점성 배지, (3) 신뢰할 수 있게 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차에 대한 자세한 설명을 포함하고 있다는 점에서 다릅니다. 또한, 첨부 된 비디오는 플라크 분석을 수행하는 다른 사람들에게 지시 할 때 자주 놓치는 과정에서 더 미세한 구별을 입증하는 데 도움이됩니다.

표 1은 최적의 결과를 갖는 실험을 나타낸다. 모든 10배 희석은 플라크 수의 약 10배 감소를 따릅니다. 이러한 종류의 데이터는 세 번의 반복실험 모두에 대해 셀 수 있는 플라크 수가 10-4 범위에 속하는 실제 플라크 분석인 그림 2에서도 볼 수 있습니다. 도 3에서도 동일하게 볼 수 있는데, 여기서 셀 수 있는 수의 플라크는 10-3</sup...

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Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing은 집단에서 살아있는 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 일상적인 방법입니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 다양한 미생물학 커리큘럼에서 플라킹이 자주 가르쳐지지만, 포유류 바이러스의 플라킹은 더 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 단순 포진 바이러스와의 정기적 인 작업을 위해 안정적으로 기능하는 절차를 설명합니다.

단순 포진 바이러스의 플라쿼싱

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

이 프로토콜은 학생들이 개별 감염을 명확하게 식별하고 분석을 쉽게 수행 할 수 있도록 도와 주므로 바이러스 역가를 정량화하는 것이 더 효율적입니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차를 통합합니다. 이 방법은 질병에 대한 항 바이러스 치료의 정확성과 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.이 플라킹 프로토콜의 더 어려운 장애물은 플레이트를 시드하는 세포 수이며, 세포가 과밀, 건조 또는 프로세스 전반에 걸쳐 긁히지 않도록합니다. 또한이 프로토콜의 전반적인 세심한 특성에서 어려움을 겪을 수도 있습니다. 그러나 연습은이 실험의 성공의 주요 기여자입니다.시작하려면 한 실험실 세션에서 세포에 바이러스를 첨가하여 샘플 희석을 완료하십시오. PBS로 플라크되는 각 바이러스 샘플을 연속적으로 희석한다. 일반적으로 가장 정확한 추적을 위해 10배 희석을 사용합니다.이러한 희석된 바이러스 샘플을 세포에 추가할 준비가 될 때까지 모든 바이러스 희석액을 얼음 위에 보관하십시오. 피펫을 사용하여 하나 또는 두 개의 웰에서 세포 배양 배지를 제거한다. 조심스럽게 희석된 바이러스 샘플을 세포의 각 단층에 적하하여 각 웰의 측면을 통해 적가한다.전체 플레이트가 플라크되는 바이러스 샘플로 채워질 때까지 하나 또는 두 개의 웰마다 이 과정을 반복하십시오. 접시 전체를 손으로 부드럽게 흔든다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션하여 바이러스 흡착을 허용하십시오.10분마다 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 다시 부드럽게 흔들어 각 웰에 바이러스를 더 고르게 퍼뜨린 다음 다시 인큐베이터에 놓습니다. 실수로 흡수되지 않은 접종물을 세는 가능성을 줄이려면 1000 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 웰에서 바이러스 샘플을 제거하고 샘플을 폐기물 비이커에 버리십시오. 2.5 밀리리터의 메틸 셀룰로오스 오버레이를 플레이트에 놓고 인큐베이터에 다시 놓습니다.폐기물 비이커를 소독하십시오, 일반적으로 표백제, 요오도포어 또는 유사한 virucide를 첨가하여 생물 안전 캐비닛에서 제거하십시오. 이틀 인큐베이션 후, 피펫을 사용하여 한 번에 하나 또는 두 개의 웰로부터 메틸셀룰로스 오버레이를 제거하고, 이를 폐기물 비이커에 놓는다. 각 웰에 50 % 에탄올에 약 2 밀리리터의 1 % 크리스탈 바이올렛을 첨가하십시오.얼룩으로 채워진 모든 웰로 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 시점에서 이전에 입증 된 것처럼 폐기물 비커를 소독하십시오. 유출이 맑을 때까지 수돗물로 접시를 격렬하게 씻으십시오.각 희석 시리즈에 걸쳐 플라크 수에 약 10배 차이가 있는지 확인하십시오. 이 그림은 세 번의 반복실험 모두에 대해 셀 수 있는 플라크 수가 10에서 마이너스 네 범위로 떨어지는 플라크 수의 10배 감소를 보여줍니다. 그림의 처음 세 이미지는 10에서 마이너스 세 희석까지의 플라크를 묘사합니다.그러나 하단 행은 플라크 분석이 잘 수행되지 않은 경우 결과를 보여줍니다. Vero 세포가 기질에서 완전히 들어 올려진 상단 주변의 가시적 인 영역에서 희석 된 플라크는 거의 없습니다. 유사하게, 이 그림은 플라크 분석 동안 세포가 건조되거나 잘못 취급되는 문제를 보여준다.그러나이 수치는 빈약 한 베로 세포 시딩을 비판적으로 보여줍니다. 모든 우물은 더 짙은 보라색 반점을 보여 주며, 세포가 우물을 가로 질러 잘 퍼지지 않고 클러스터에서 서로 위에 쌓여 있음을 나타냅니다. 최상의 결과를 얻으려면 바이러스가 플레이트 전체에 균일하게 확산되어 플라크 분석이 살아있는 바이러스 만 계산하기 때문에 다른 정량적 방법보다 더 효과적입니다.그렇게하면 진정한 항 바이러스 효능이 확립 될 수 있습니다. 또한,이 기술을 통해 우리는 fomite에 대한 바이러스 존재를 정량화하고 헤르페스 바이러스 연구 분야의 새로운 의료 기기에서 약물 전달의 효과를 탐구 할 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

연구

면역학 및 감염병학

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...