Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Vi takker utallige studenter i laboratoriene våre (PJD og BJM) som har jobbet med oss gjennom årene med å raffinere disse metodene. En spesiell takk til Stan Person, under hvis veiledning denne metodikken først ble utviklet. Dette arbeidet ble delvis støttet av Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund og NIGMS Bridges til Baccalaureate grant 5R25GM058264. Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences.

Alle prosedyrer med Vero-cellene og levende herpesvirus er godkjent av Towson University Institutional Biosafety Committee. En generalisert ordning av disse prosedyrene er representert i figur 1.
1. Såing av Vero-cellene
<ol><li>Dagen før du starter plakkanalysen, må du prøve å initiere Vero-celler og bruke dem på nytt i vanlig Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) og supplere i henhold til standard cellekulturmetodikk1...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Mens plakkanalyser er nesten like gamle som pattedyrcellekulturen selv, ser det ut til at hvert laboratorium har sitt eget sett med protokoller for å utføre denne grunnleggende analysen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20</s...

Begynnelsen av virusplakkanalyser går tilbake til de første oppdagelsene av virus på 1890-tallet1. Tobakk mosaikkvirus ble først isolert og overført på tobakkblader, hvor individuelle infeksjonsflekker kunne gjenkjennes og kvantifiseres som opprinnelse fra en enkelt, levende virusenhet2, senere identifisert som en virion2. Senere seminalstudier med bakterier og bakteriofager perfeksjonerte teknikkene som brukes til å plakk disse virusene, inkludert bakterier i midtloggfasen av vekst, seriell fortynning av bakteriofageprøver og toppagar med etterfølgende visualisering av bokstavelige hull (navngitte plakk) i bakteriell plen3.
Plaquing av dyrevirus forsinket den spennende forskningen som ble utført med bakteriofager, hovedsakelig fordi metodene som kreves for å dyrke pattedyrceller i kultur ikke ble utviklet før på 1940-tallet4. Imidlertid skapte ankomsten av voksende murine celler i fravær av hele vertsorganismen4 en ny epoke i evnen til å kultur og telle virus. Slikt arbeid ble utvidet for forplantning og kvantasjon av Western Equine Encephalomyelittvirus i kyllingceller og poliovirus i menneskelige celler5,6. Etter hvert som riket av dyrkbare pattedyrceller utvidet seg, ga bevy av forskjellige vertsceller for ulike virusinfeksjoner verden en cornucopia av muligheter til å studere alle slags virus7. Dette inkluderte forplantning og kvantifisering av humane herpesvirus, spesielt herpes simplex virus-1 (HSV-1) og -2 (HSV-2), som forårsaker mucocutaneous lesjoner8. Viktigst er at alle plakkanalyser er avhengige av eksistensen av levende virioner, som kan komme inn i vertsceller på en reseptormediert måte i en prøve9. Uavhengig av allestedsnærværende og mange publikasjoner om utførelsen av plakettanalyser5,10,11,12,13,14,15,16, er disse metodene for HSV-1/-2 en blanding av både kunst og vitenskap; man kan ikke gjennomføre analysen uten riktig oppmerksomhet på hver detalj i protokollen, og man kan heller ikke utføre en vellykket analyse uten et crticial øye for subtilitet i prosessen. Dette manuskriptet skildrer en av de mest konsekvent reproduserbare metodene for HSV-1/-2 plakettanalyser, med presise detaljer om analysens kunst som sjelden diskuteres.
Denne aktuelle protokollen oppnår live plakkdannende enheter (PFU) teller for HSV-1 og -2 pålitelig. Beste resultater oppnås ved hjelp av Vero celler (transformert afrikansk grønn ape nyre epitelceller) ved lav passasje (under passasje nummer 155) og rutinemessig vokst i alfa-MEM17 supplert med 10% fosterkalv serum (FCS), L-alanyl-L-glutamin, og en antibiotika / antimykotisk blanding18. Vero-celler forplantes standard i dette mediet to til tre ganger i uken ved en 1/5 fortynning hver gang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Det er mange publiserte protokoller for plaquing virus, inkludert referanser innen primærlitteratur for metodikk. Det kan imidlertid være vanskelig å utføre plaquing-virus, noe som krever fokus på spesifikasjoner og raffinement. Det er en utrolig utfordrende metode for nye studenter å mestre, hovedsakelig fordi det krever omhyggelig oppmerksomhet til de fleste minutters detaljer. Denne demonstrasjonen av plaquing herpes simplex virus bør hjelpe de som har slitt med å visualisere metoden, spesielt dens nyanser, gjennom årene. Selv om dette manuskriptet er basert på de samme prinsippene for standard plaquing-metodikk, er det forskjellig ved at det inneholder en detaljert beskrivelse av (1) hvordan man best kan håndtere vertsceller for å unngå forstyrrelser under prosessen, (2) et mer nyttig viskøs medium enn agarose for å begrense spredningen av virioner, og (3) en enkel fikserings- og fargingsprosedyre som gir pålitelig reproduserbare resultater. Videre bidrar den medfølgende videoen til å demonstrere de finere forskjellene i prosessen, som ofte går glipp av når de instruerer andre om å gjennomføre plakkanalyser.

Tabell 1 viser et eksperiment som har optimale resultater. Alle 10 ganger fortynninger følger en ca. 10 ganger reduksjon i antall plakk. Denne typen data kan også ses i figur 2, en faktisk plakettanalyse der det tellbare antallet plakk falt i 10-4-området for alle tre replikeringene. Det samme kan ses i figur 3, den øverste raden, hvor det tellbare antall plakk var i 10-3 fortynning.
<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing er en rutinemessig metode som brukes til å kvantifisere levende virus i en befolkning. Selv om plaquing ofte undervises i ulike mikrobiologiske læreplaner med bakterier og bakteriofager, er plaquing av pattedyrvirus mer kompleks og tidkrevende. Denne protokollen beskriver prosedyrene som fungerer pålitelig for vanlig arbeid med herpes simplex virus.

Plaquing av Herpes Simplex Virus

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokollen hjelper studentene med å identifisere individuelle infeksjoner tydelig og utføre analysen enkelt, noe som gjør det mer effektivt å kvantifisere viral titer. Denne protokollen inneholder en enkel fikserings- og fargingsprosedyre som gir pålitelige og reproduserbare resultater. Denne metoden kan gi innsikt i nøyaktigheten og effektiviteten av antivirale behandlinger mot sykdommer.De vanskeligere hindringene i denne plaquing-protokollen er celletallene for såingsplater, og sørger for at cellene ikke overbefolker, tørker ut eller blir riper gjennom hele prosessen. Man kan også finne vanskeligheter med den generelle omhyggelige karakteren av denne protokollen. Praksis er imidlertid en viktig bidragsyter til suksessen til dette eksperimentet.For å begynne med, fullfør prøvefortynning i tillegg av virus til celler i en laboratorieøkt. Fortynn hver virusprøve som plakkeres i PBS serielt. Bruk vanligvis 10 ganger fortynning for mest presis sporing.Hold alle virale fortynninger på is til de er klare til å legge til disse fortynnede virusprøvene til cellene. Fjern cellekulturmediet fra en eller to brønner ved hjelp av en pipette. Tilsett forsiktig den fortynnede virusprøven dråpevis til hvert monolag av celler som fallervis gjennom siden av hver brønn.Gjenta prosessen for hver eneste eller to brønner til hele platen er fylt med virusprøvene som plakkes. Gyng forsiktig hele platen for hånd. Deretter inkuberer platen på 37 grader Celsius i en time for å tillate viruset adsorpsjon.Etter hvert 10. minutt, fjern platen fra inkubatoren, rock den forsiktig igjen for å spre viruset jevnere over hver brønn, og plasser den deretter tilbake i inkubatoren. For å redusere muligheten for utilsiktet telling av unabsorbed inoculum, fjern virusprøven fra brønnene ved hjelp av en pipettespiss på 1000 mikroliter og kast prøven i et avfallsbeger. Plasser 2,5 milliliter metylcelluloseoverlegg på platen, og legg den tilbake i inkubatoren.Desinfiser avfallsbegeret, vanligvis med tilsetning av blekemiddel, en iodofor eller en lignende virucide, før du fjerner den fra biosikkerhetsskapet. Etter to-dagers inkubasjon, fjern metylcelluloseoverlegget fra en eller to brønner om gangen ved hjelp av en pipette, og legg den i et avfallsbeger. Tilsett omtrent to milliliter 1% krystallfiolett i 50% etanol til hver brønn.Inkuber platen med alle brønner fylt med flekken i 30 minutter ved 37 grader Celsius. På dette tidspunktet desinfiserer du avfallsbegeret som vist tidligere. Vask platene kraftig med vann fra springen til avrenningen er klar.Påse at det er ca. 10 ganger forskjeller i antall plakk på tvers av hver fortynningsserie. Figuren viser en 10 ganger reduksjon i antall plakk der det tellbare antallet plaketter falt i området 10 til minus fire for alle tre replikeringene. De tre første bildene i figuren viser plaketter i 10 til minus tre fortynning.Den nederste raden viser imidlertid resultater når en plakkanalyse ikke utføres bra. Det er svært få plakk synlige fra enhver fortynning i de synlige områdene rundt toppen der Vero-cellene helt har løftet seg fra substratet. På samme måte viser denne figuren problemer med celler som tørker ut eller feilbehandling under plakkanalysen.Denne figuren viser imidlertid kritisk dårlig Vero-cellesåing. Hver brønn viser mørkere lilla flekker, indikativ for celler som ikke er spredt godt over brønnen og stablet oppå hverandre i klynger. For best resultat, sørg for at viruset er spredt jevnt over platen for å unngå klumpet opp plakk Plaque analyser er mer effektive enn andre kvantitative metoder fordi det bare teller levende virus.På den måten kan ekte antiviral effekt etableres. I tillegg har denne teknikken gjort det mulig for oss å kvantifisere viral tilstedeværelse på fomitter og utforske effektiviteten av legemiddellevering fra nye medisinske enheter innen vår sektor av herpesvirusforskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter virus for å kvantifisere Viral funksjon på alle stadier av Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvise Vekst Konkurranse analyse for Bestemme Replication Fitness av humant immunsviktvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rapid Molecular Detection og Differensiering av influensavirus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...