Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Agradecemos a inúmeros alunos de nossos laboratórios (PJD e BJM) que trabalharam conosco ao longo dos anos refinando esses métodos. Um agradecimento especial a Stan Person, sob cuja tutela esta metodologia foi desenvolvida pela primeira vez. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo fundo de apoio à pesquisa da Towson University Fisher College of Science and Math E nigms Bridges para a bolsa baccalaureate 5R25GM058264. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos com as células Vero e herpesvírus vivos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade de Towson. Um esquema generalizado desses procedimentos está representado na Figura 1.
1. Semeadura das células Vero
<ol><li>Um dia antes de iniciar o ensaio da placa, trippsinize células Vero e resuspensá-las no Médio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco regular e suplemento conforme metodologia...

<ol>
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Embora os ensaios de placa sejam quase tão antigos quanto a própria cultura celular de mamíferos, parece que cada laboratório tem seu próprio conjunto de protocolos para executar este ensaio básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup class="xre...

Os primórdios dos ensaios da placa do vírus remontam às primeiras descobertas de vírus na década de 18901. O vírus do mosaico do tabaco foi primeiro isolado e transmitido sobre as folhas de tabaco, onde as manchas individuais de infecção poderiam ser reconhecidas e quantificadas como originárias de uma única entidade de vírus vivo2, posteriormente identificada como virion2. Estudos seminais posteriores com bactérias e bacteriófagos aperfeiçoaram as técnicas usadas para aplacar esses vírus, incluindo bactérias na fase de crescimento de tronco médio, diluição serial de amostras de bacteriófago, e ágar superior com visualização subsequente de buracos literais (placas nomeadas) no gramado bacteriano3.
O plaquamento de vírus animais atrasou a emocionante pesquisa que está sendo conduzida com bacteriófagos, principalmente porque os métodos necessários para o cultivo de células de mamíferos na cultura não foram desenvolvidos até a década de 19404. No entanto, o advento do crescimento das células murinas na ausência de todo o organismo hospedeiro4 gerou uma nova era na capacidade de cultura e contagem de vírus. Tal trabalho foi estendido para a propagação e quantitação do vírus da Encefalomielite Equina Ocidental em células de frango e poliovírus em células humanas5,6. À medida que o reino das células mamíferas culturable se expandiu, o bando de diferentes células hospedeiras para várias infecções virais deu ao mundo uma cornucópia de possibilidades de estudar todos os tipos de vírus7. Isso incluiu a propagação e quantificação de herpesvírus humanos, particularmente herpes simplex vírus-1 (HSV-1) e -2 (HSV-2), que causam lesões mucocutâneas8. É importante ressaltar que todos os ensaios de placa dependem da existência de virions vivos, que podem entrar em células hospedeiras de forma mediada por receptores em uma amostra9. Independentemente da onipresença e da multiplicidade de publicações sobre a execução de ensaios de placa5,10,11,12,13,14,15,16, esses métodos para O HSV-1/2 são uma mistura de arte e ciência; não se pode conduzir o ensaio sem a devida atenção a cada detalhe no protocolo, nem se pode executar um ensaio bem sucedido sem um olhar crticial para a sutileza no processo. Este manuscrito retrata um dos métodos mais consistentemente reprodutíveis para ensaios de placas HSV-1/2, com detalhes precisos para a arte do ensaio que raramente são discutidos.
Este protocolo atual obtém as contagens de unidades de formação de placas vivas (PFU) para HSV-1 e -2 de forma confiável. Os melhores resultados são obtidos utilizando células Vero (células epiteliais de macaco verde africano transformado) em baixa passagem (abaixo da passagem número 155) e cultivados rotineiramente em alfa-MEM17 suplementados com soro de bezerro fetal 10% (FCS), L-alanyl-L-glutamina, e uma mistura antibiótico/antimíctico18. As células vero são padronizadas neste meio de duas a três vezes por semana a uma diluição de 1/5 cada vez.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Existem inúmeros protocolos publicados para plaquamento de vírus, incluindo referências dentro da literatura primária para metodologia. No entanto, plaquing vírus pode ser difícil de executar, exigindo foco em suas especificações e refinamento. É um método incrivelmente desafiador para novos alunos dominarem, principalmente porque requer uma atenção meticulosa aos detalhes mais minuciosos. Essa demonstração de plaquamento de vírus herpes simplex deve ajudar aqueles que têm lutado para visualizar o método, especialmente suas nuances, ao longo dos anos. Embora este manuscrito se baseie nos mesmos princípios da metodologia de plaquing padrão, ele difere na sua descrição detalhada de (1) a melhor forma de lidar com células hospedeiras para evitar interrupções durante o processo, (2) um meio viscoso mais útil do que surgiu para limitar a difusão de virions, e (3) um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados relisivelmente reprodutíveis. Além disso, o vídeo que acompanha ajuda a demonstrar as distinções mais finas no processo, que são frequentemente perdidas ao instruir outros sobre a realização de ensaios de placa.

A Tabela 1 mostra um experimento que tem resultados ótimos. Todas as diluições de 10 vezes seguem uma redução de aproximadamente 10 vezes na contagem de placas. Esses tipos de dados também podem ser vistos na Figura 2, um ensaio de placa real onde o número contável de placas caiu na faixa 10-4 para todas as três réplicas. O mesmo pode ser visto na Figura 3, a linha superior, onde o número contável de placas estava na dilui...

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Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing é um método de rotina usado para quantificar vírus vivos em uma população. Embora o plaquing seja frequentemente ensinado em vários currículos de microbiologia com bactérias e bacteriófagos, o plaquamento de vírus mamíferos é mais complexo e demorado. Este protocolo descreve os procedimentos que funcionam de forma confiável para o trabalho regular com vírus herpes simplex.

Plaquing de Vírus Herpes Simplex

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

O protocolo ajuda os alunos a identificar infecções individuais de forma clara e realizar o ensaio facilmente, tornando-se mais eficiente quantificar o título viral. Este protocolo incorpora um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados confiáveis e reprodutíveis. Este método pode fornecer uma visão da precisão e eficácia dos tratamentos antivirais contra doenças.Os obstáculos mais difíceis deste protocolo de plaquamento são a contagem de células para semeadura de placas, certificando-se de que as células não superlotam, secam ou são arranhadas durante todo o processo. Pode-se também encontrar dificuldade na natureza meticulosa geral deste protocolo. No entanto, a prática é um dos principais contribuintes do sucesso deste experimento.Para começar, complete a diluição amostral na adição de vírus às células em uma sessão de laboratório. Diluir em série cada amostra de vírus sendo emplacida na PBS. Normalmente, use diluições de 10 vezes para o rastreamento mais preciso.Mantenha todas as diluições virais no gelo até que estejam prontas para adicionar essas amostras de vírus diluídas às células. Remova o meio de cultura celular de um ou dois poços usando uma pipeta. Adicione cuidadosamente a amostra do vírus diluído dropwise a cada monocamada de células dropwise através do lado de cada poço.Repita o processo para cada um ou dois poços até que toda a placa esteja preenchida com as amostras do vírus sendo emplacados. Balance suavemente a placa inteira à mão. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir a adsorção do vírus.Depois de 10 minutos, retire a placa da incubadora, balance-a suavemente novamente para espalhar o vírus mais uniformemente em cada poço, e depois coloque-a de volta na incubadora. Para diminuir a possibilidade de contar inadvertidamente o inóculo não absorvido, remova a amostra do vírus dos poços usando uma ponta de pipeta de 1000 microliter e descarte a amostra em um béquer de resíduos. Coloque 2,5 mililitros de uma sobreposição de metilcelulose na placa e coloque-a de volta na incubadora.Desinfete o béquer de resíduos, tipicamente com a adição de alvejante, um iodophor, ou um virucida semelhante, antes de removê-lo do armário de biossegurança. Após a incubação de dois dias, remova a sobreposição de metilcelulose de um ou dois poços de cada vez usando uma pipeta e coloque-a em um béquer de resíduo. Adicione aproximadamente dois mililitros de 1% de violeta cristalina em 50% de etanol para cada poço.Incubar a placa com todos os poços preenchidos com a mancha por 30 minutos a 37 graus Celsius. Neste ponto, desinfete o béquer de resíduos como demonstrado anteriormente. Lave as placas vigorosamente com água da torneira até que o escoamento esteja limpo.Certifique-se de que há aproximadamente 10 vezes diferenças no número de placas em cada série de diluição. A figura retrata uma redução de 10 vezes na contagem de placas onde o número contável de placas caiu na faixa de 10 para menos quatro para todas as três réplicas. As três primeiras imagens na figura retratam placas na diluição de 10 a menos três.No entanto, a linha inferior mostra resultados quando um ensaio de placa não é bem conduzido. Há muito poucas placas visíveis de qualquer diluição nas áreas visíveis ao redor do topo onde as células Vero foram totalmente levantadas do substrato. Da mesma forma, esta figura mostra problemas com células secando ou manipulando mal durante o ensaio da placa.No entanto, este número mostra criticamente a pobre semeadura celular Vero. Cada poço mostra manchas roxas mais escuras, indicativas de células não se espalham bem pelo poço e empilhadas umas sobre as outras em aglomerados. Para obter melhores resultados, certifique-se de que o vírus se espalhe uniformemente pela placa para evitar placas agrupadas Os ensaios da placa são mais eficazes do que outros métodos quantitativos, pois ele só conta vírus vivo.Dessa forma, a verdadeira eficácia antiviral pode ser estabelecida. Além disso, essa técnica nos permitiu quantificar a presença viral em fomites e explorar a eficácia da entrega de medicamentos a partir de novos dispositivos médicos dentro do nosso setor de pesquisa sobre vírus herpes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Imunologia e Infecção

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...