Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Agradecemos a innumerables estudiantes en nuestros laboratorios (PJD y BJM) que han trabajado con nosotros a lo largo de los años refinando estos métodos. Un agradecimiento especial a Stan Person, bajo cuya tutela se desarrolló por primera vez esta metodología. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el fondo de apoyo a la investigación de pregrado fisher College of Science and Math de la Universidad de Towson y la subvención NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos con las células Vero y los herpesvirus vivos han sido aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Towson. En la Figura 1 se representa un esquema generalizado de estos procedimientos.
1. Siembra de las células Vero
<ol><li>El día antes de iniciar el ensayo de placa, tripsinize las células Vero y resuspóndelas en el Medio Modified Eagles (DMEM) de Dulbecco regular y complemente según ...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. 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M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Si bien los ensayos de placa son casi tan antiguos como el propio cultivo celular de mamíferos, parece que cada laboratorio tiene su propio conjunto de protocolos para ejecutar este ensayo básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 </s...

Los inicios de los ensayos de placa viral se remontan a los primeros descubrimientos de virus en la década de 18901. El virus del mosaico del tabaco se aisló por primera vez y se transmitió a las hojas de tabaco, donde las manchas individuales de infección pudieron reconocerse y cuantificarse como originarias de una sola entidad de virus viva2, más tarde identificada como un virión2. Estudios seminales posteriores con bacterias y bacteriófagos perfeccionaron las técnicas utilizadas para placar estos virus, incluidas las bacterias en la fase media del crecimiento, la dilución en serie de muestras de bacteriófagos y el agar superior con la posterior visualización de agujeros literales (llamadas placas) en el césped bacteriano3.
La detección de virus animales retrasó la emocionante investigación que se estaba llevando a cabo con bacteriófagos, principalmente porque los métodos requeridos para cultivar células de mamíferos en cultivo no se desarrollaron hasta la década de 19404. Sin embargo, el advenimiento del crecimiento de células murinas en ausencia de todo el organismo huésped4 generó una nueva era en la capacidad de cultivar y contar virus. Dicho trabajo se amplió para la propagación y cuantificación del virus de la encefalomielitis equina occidental en células de pollo y poliovirus en células humanas5,6. A medida que el reino de las células de mamíferos cultivables se expandió, el grupo de diferentes células huésped para diversas infecciones virales le dio al mundo una cornucopia de posibilidades para estudiar todo tipo de virus7. Esto incluyó la propagación y cuantificación de herpesvirus humanos, particularmente virus del herpes simple-1 (HSV-1) y -2 (HSV-2), que causan lesiones mucocutáneas8. Es importante destacar que todos los ensayos de placa dependen de la existencia de viriones vivos, que pueden ingresar a las células huésped de manera mediada por receptores en una muestra9. Independientemente de la ubicuidad y la multitud de publicaciones sobre la ejecución de ensayos de placa5,10,11,12,13,14,15,16, estos métodos para HSV-1/-2 son una mezcla de arte y ciencia; no se puede llevar a cabo el ensayo sin la debida atención a cada detalle en el protocolo, ni se puede ejecutar un ensayo exitoso sin un ojo crticial para la sutileza en el proceso. Este manuscrito describe uno de los métodos reproducibles más consistentemente para los ensayos de placa HSV-1/-2, con detalles precisos hacia el arte del ensayo que rara vez se discuten.
Este protocolo actual obtiene recuentos de unidades formadoras de placa viva (PFU) para HSV-1 y -2 de manera confiable. Los mejores resultados se obtienen utilizando células Vero (células epiteliales de riñón de mono verde africano transformadas) a paso bajo (por debajo del número de paso 155) y cultivadas rutinariamente en alfa-MEM17 suplementadas con 10% de suero fetal de ternero (FCS), L-alanil-L-glutamina y una mezcla antibiótica/antimicótica18. Las células Vero se propagan estándarmente en este medio dos o tres veces por semana a una dilución de 1/5 cada vez.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Existen numerosos protocolos publicados para detectar virus, incluidas referencias dentro de la literatura primaria para la metodología. Sin embargo, la detección de virus puede ser difícil de realizar, lo que requiere centrarse en sus especificaciones y refinamiento. Es un método increíblemente desafiante para que los nuevos estudiantes lo dominen, principalmente porque requiere una atención meticulosa a los detalles más minuciosos. Esta demostración de plagar los virus del herpes simple debería ayudar a aquellos que han luchado con la visualización del método, especialmente sus matices, a lo largo de los años. Si bien este manuscrito se basa en los mismos principios de la metodología estándar de plaquing, difiere en que contiene una descripción detallada de (1) la mejor manera de manejar las células huésped para evitar interrupciones durante el proceso, (2) un medio viscoso más útil que la agarosa para limitar la difusión de viriones, y (3) un procedimiento simple de fijación y tinción que produce resultados reproducibles de manera confiable. Además, el video que lo acompaña ayuda a demostrar las distinciones más finas en el proceso, que con frecuencia se pasan por alto cuando se instruye a otros sobre la realización de ensayos de placa.

La Tabla 1 muestra un experimento que tiene resultados óptimos. Todas las diluciones de 10 veces siguen a una disminución de aproximadamente 10 veces en los recuentos de placa. Este tipo de datos también se pueden ver en la Figura 2, un ensayo de placa real donde el número contable de placas cayó en el rango de 10-4 para las tres réplicas. Lo mismo se puede ver en la Figura 3, la fila superior, donde el número contable de placa...

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Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing es un método de rutina utilizado para cuantificar virus vivos en una población. Aunque el plaquing se enseña con frecuencia en varios currículos de microbiología con bacterias y bacteriófagos, el plaquing de virus de mamíferos es más complejo y requiere más tiempo. Este protocolo describe los procedimientos que funcionan de manera confiable para el trabajo regular con virus del herpes simple.

Plaquing de los virus del herpes simple

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

El protocolo ayuda a los estudiantes a identificar claramente las infecciones individuales y realizar el ensayo fácilmente, lo que hace que sea más eficiente cuantificar el título viral. Este protocolo incorpora un sencillo procedimiento de fijación y tinción que produce resultados fiables y reproducibles. Este método puede proporcionar información sobre la precisión y la eficacia de los tratamientos antivirales contra las enfermedades.Los obstáculos más difíciles de este protocolo de plaquing son los recuentos de células para las placas de siembra, asegurándose de que las células no se abarroten, se sequen o se rayen durante todo el proceso. También se puede encontrar dificultad en la naturaleza meticulosa general de este protocolo. Sin embargo, la práctica es un importante contribuyente al éxito de este experimento.Para comenzar, complete la dilución de la muestra en la adición de virus a las células en una sesión de laboratorio. Diluir en serie cada muestra de virus que se está placando en PBS. Por lo general, use diluciones de 10 veces para un seguimiento más preciso.Mantenga todas las diluciones virales en hielo hasta que esté listo para agregar estas muestras de virus diluidas a las células. Retire el medio de cultivo celular de uno o dos pocillos con una pipeta. Agregue cuidadosamente la muestra de virus diluida gota a gota a cada monocapa de células gota a gota a través del lado de cada pozo.Repita el proceso por cada uno o dos pocillos hasta que toda la placa se llene con las muestras de virus que se están placando. Mece suavemente todo el plato a mano. Luego incube la placa a 37 grados centígrados durante una hora para permitir la adsorción del virus.Después de cada 10 minutos, retire la placa de la incubadora, vuelva a mecerla suavemente para propagar el virus de manera más uniforme a través de cada pozo y luego colóquela nuevamente en la incubadora. Para disminuir la posibilidad de contar inadvertidamente el inóculo no absorbido, retire la muestra de virus de los pozos utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros y deseche la muestra en un vaso de precipitados de desecho. Coloque 2.5 mililitros de una superposición de metilcelulosa en la placa y colóquela nuevamente en la incubadora.Desinfecte el vaso de precipitados residual, generalmente con la adición de lejía, un yodóforo o un virucida similar, antes de retirarlo del gabinete de bioseguridad. Después de la incubación de dos días, retire la superposición de metilcelulosa de uno o dos pozos a la vez con una pipeta y colóquela en un vaso de precipitados de desecho. Agregue aproximadamente dos mililitros de violeta de cristal al 1% en etanol al 50% a cada pozo.Incubar la placa con todos los pocillos llenos de la mancha durante 30 minutos a 37 grados centígrados. En este punto, desinfecte el vaso de precipitados residual como se demostró anteriormente. Lave las placas vigorosamente con agua del grifo hasta que la escorrentía esté clara.Asegúrese de que haya diferencias de aproximadamente 10 veces en el número de placas en cada serie de dilución. La figura representa una disminución de 10 veces en los recuentos de placas donde el número contable de placas cayó en el rango de 10 a menos cuatro para las tres réplicas. Las tres primeras imágenes de la figura representan placas en la dilución de 10 a menos tres.Sin embargo, la fila inferior muestra resultados cuando un ensayo de placa no se realiza bien. Hay muy pocas placas visibles de cualquier dilución en las áreas visibles alrededor de la parte superior donde las células Vero se han levantado completamente del sustrato. Del mismo modo, esta figura muestra problemas con las células que se secan o se manejan mal durante el ensayo de placa.Sin embargo, esta cifra muestra críticamente una mala siembra de células Vero. Cada pozo muestra manchas púrpuras más oscuras, indicativas de células que no se extienden bien por el pozo y se apilan una encima de la otra en grupos. Para obtener los mejores resultados, asegúrese de que el virus se propague uniformemente a través de la placa para evitar placas agrupadas Los ensayos de placa son más efectivos que otros métodos cuantitativos porque solo cuentan el virus vivo.De esa manera, se puede establecer una verdadera eficacia antiviral. Además, esta técnica nos ha permitido cuantificar la presencia viral en los fómites y explorar la efectividad de la administración de fármacos a partir de nuevos dispositivos médicos dentro de nuestro sector de investigación del virus del herpes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal