Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Vi tackar otaliga studenter i våra laboratorier (PJD och BJM) som har arbetat med oss genom åren för att förfina dessa metoder. Ett särskilt tack till Stan Person, under vars ledning denna metod först utvecklades. Detta arbete stöddes delvis av Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund och NIGMS Bridges till Baccalaureate-bidraget 5R25GM058264. Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences.

Alla procedurer med Vero-cellerna och levande herpesvirus har godkänts av Towson University Institutional Biosafety Committee. Ett generaliserat schema för dessa förfaranden representeras i figur 1.
1. Sådd av Vero-cellerna
<ol><li>Dagen innan plackanalysen påbörjas, trypsinisera Vero-celler och resuspendera dem i vanliga Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) och komplettera enligt standardmetodik för cellodling19</sup...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Medan plackanalyser är nästan lika gamla som däggdjurscellodling i sig, verkar det som om varje laboratorium har sin egen uppsättning protokoll för att utföra denna grundläggande analys5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<su...

Början av virusplackanalyser går tillbaka till de första upptäckterna av virus på 1890-talet1. Tobaksmosaikvirus isolerades först och fördes vidare tobaksblad, där enskilda infektionsfläckar kunde erkännas och kvantifieras som härrörande från en enda, levande virusenhet2, som senare identifierades som en virion2. Senare nyskapande studier med bakterier och bakteriofager fulländade de tekniker som användes för att plackera dessa virus, inklusive bakterier i mitten av loggfasen av tillväxt, seriell utspädning av bakteriofagprover och toppagar med efterföljande visualisering av bokstavliga hål (namngivna plack) i bakteriegräsmattan3.
Plaquing av djurvirus släpade efter den spännande forskning som bedrevs med bakteriofager, främst för att de metoder som krävdes för att odla däggdjursceller i odling inte utvecklades förrän på 1940-talet4. Tillkomsten av växande murina celler i frånvaro av hela värdorganismen4 skapade emellertid en ny era i förmågan att odla och räkna virus. Sådant arbete utvidgades för förökning och kvantitation av Western Equine Encephalomyelitis virus i kycklingceller och poliovirus i mänskliga celler5,6. I takt med att sfären av odlingsbara däggdjursceller expanderade gav mängden olika värdceller för olika virusinfektioner världen ett ymnighetshorn av möjligheter att studera alla slags virus7. Detta inkluderade förökning och kvantifiering av humana herpesvirus, särskilt herpes simplexvirus-1 (HSV-1) och -2 (HSV-2), som orsakar mukokutana lesioner8. Viktigt är att alla plackanalyser är beroende av förekomsten av levande virioner, som kan komma in i värdceller på ett receptormedierat sätt i ett prov9. Oavsett allestädes närvarande och många publikationer om utförandet av plackanalyser5,10,11,12,13,14,15,16 är dessa metoder för HSV-1/-2 en blandning av både konst och vetenskap; man kan inte genomföra analysen utan ordentlig uppmärksamhet på varje detalj i protokollet, och man kan inte heller utföra en framgångsrik analys utan ett kritiellt öga för subtilitet i processen. Detta manuskript visar en av de mest konsekvent reproducerbara metoderna för HSV-1/-2-plackanalyser, med exakta detaljer mot analysens konst som sällan diskuteras.
Detta nuvarande protokoll erhåller levande plackbildande enheter (PFU) för HSV-1 och -2 på ett tillförlitligt sätt. De bästa resultaten erhålls med hjälp av Vero-celler (transformerade afrikanska gröna apa njurepitelceller) vid låg passage (under passage nummer 155) och rutinmässigt odlas i alfa-MEM17 kompletterat med 10% fetal kalvserum (FCS), L-alanyl-L-glutamin och en antibiotika/antimykotisk blandning18. Veroceller förökas vanligtvis i detta medium två till tre gånger per vecka vid en 1/5 utspädning varje gång.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Det finns många publicerade protokoll för att plaquing virus, inklusive referenser inom primär litteratur för metodik. Att plaquing virus kan dock vara svårt att utföra, vilket kräver fokus på dess specifikationer och förfining. Det är en otroligt utmanande metod för nya studenter att behärska, främst för att det kräver noggrann uppmärksamhet åt de minsta detaljerna. Denna demonstration av plaquing herpes simplexvirus bör hjälpa dem som har kämpat med att visualisera metoden, särskilt dess nyanser, genom åren. Även om detta manuskript är baserat på samma principer för standard plaquing metodik, skiljer det sig åt genom att det innehåller en detaljerad beskrivning av (1) hur man bäst hanterar värdceller för att undvika störningar under processen, (2) ett mer användbart visköst medium än agaros för att begränsa diffusionen av virioner, och (3) ett enkelt fixerings- och färgningsförfarande som ger tillförlitligt reproducerbara resultat. Dessutom hjälper den medföljande videon till att visa de finare skillnaderna i processen, som ofta missas när man instruerar andra om att genomföra plackanalyser.

Tabell 1 visar ett experiment som har optimala resultat. Alla 10-faldiga utspädningar följer en ungefär 10-faldig minskning av plackantalet. Dessa typer av data kan också ses i figur 2, en faktisk plackanalys där det räknebara antalet plack föll i intervallet 10-4 för alla tre replikaten. Detsamma kan ses i figur 3, den övre raden, där det räknebara antalet plack var i 10-3-utspädningen.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaquing är en rutinmetod som används för att kvantifiera levande virus i en population. Även om plaquing ofta lärs ut i olika mikrobiologiska läroplaner med bakterier och bakteriofager, är plaquing av däggdjursvirus mer komplex och tidskrävande. Detta protokoll beskriver de procedurer som fungerar tillförlitligt för regelbundet arbete med herpes simplexvirus.

Plaquing av herpes simplexvirus

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokollet hjälper eleverna att identifiera enskilda infektioner tydligt och utföra analysen enkelt, vilket gör det mer effektivt att kvantifiera viral titer. Detta protokoll innehåller ett enkelt fixerings- och färgningsförfarande som ger tillförlitliga och reproducerbara resultat. Denna metod kan ge insikt i noggrannheten och effektiviteten av antivirala behandlingar mot sjukdomar.De svårare hindren för detta plaquingprotokoll är cellantalet för såddplattor, se till att cellerna inte överbefolkas, torkar ut eller repas under hela processen. Man kan också finna svårigheter i den övergripande noggranna karaktären av detta protokoll. Övning är dock en viktig bidragsgivare till framgången med detta experiment.Börja med att slutföra provutspädningen i tillsats av virus till celler i en laboratoriesession. Späd seriellt varje virusprov som plackas i PBS. Använd vanligtvis 10-faldiga utspädningar för mest exakt spårning.Håll alla virala utspädningar på is tills du är redo att tillsätta dessa utspädda virusprover till cellerna. Ta bort cellodlingsmediet från en eller två brunnar med en pipett. Tillsätt försiktigt det utspädda virusprovet droppvis till varje monolager av celler droppvis genom sidan av varje brunn.Upprepa processen för varje en eller två brunnar tills hela plattan är fylld med virusproverna som plackas. Gunga försiktigt hela plattan för hand. Inkubera sedan plattan vid 37 grader Celsius i en timme för att tillåta virusadsorptionen.Efter var 10: e minut, ta bort plattan från inkubatorn, rocka den försiktigt igen för att sprida viruset jämnare över varje brunn och placera den sedan tillbaka i inkubatorn. För att minska möjligheten att oavsiktligt räkna oabsorberad ympning, ta bort virusprovet från brunnarna med en 1000 mikroliter pipettspets och kasta provet i en avfallsbägare. Placera 2,5 ml av ett metylcellulosaöverlägg på plattan och placera det tillbaka i inkubatorn.Desinficera avfallsbägaren, vanligtvis med tillsats av blekmedel, en jodofor eller en liknande virucid, innan du tar bort den från biosäkerhetsskåpet. Efter två dagars inkubation, ta bort metylcellulosaöverlägget från en eller två brunnar i taget med en pipett och placera den i en avfallskällare. Tillsätt cirka två milliliter 1% kristallviolett i 50% etanol till varje brunn.Inkubera plattan med alla brunnar fyllda med fläcken i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Desinficera vid denna tidpunkt avfallsägaren som visats tidigare. Tvätta plattorna kraftigt med kranvatten tills avrinningen är klar.Se till att det finns ungefär 10-faldiga skillnader i antalet plack över varje utspädningsserie. Figuren visar en 10-faldig minskning av antalet plack där det räknebara antalet plack sjönk i intervallet 10 till minus fyra för alla tre replikaten. De tre första bilderna i figuren visar plack i 10 till minus tre utspädning.Den nedre raden visar dock resultat när en plackanalys inte utförs bra. Det finns väldigt få plack synliga från någon utspädning i de synliga områdena runt toppen där Vero-cellerna helt har lyft från substratet. På samma sätt visar denna figur problem med celler som torkar ut eller missköts under plackanalysen.Denna siffra visar emellertid kritiskt dålig Vero-cellssådd. Varje brunn visar mörkare lila fläckar, vilket indikerar att celler inte sprids väl över brunnen och staplas ovanpå varandra i kluster. För bästa resultat, se till att viruset sprids jämnt över plattan för att undvika klumpiga plack Plackanalyser är effektivare än andra kvantitativa metoder eftersom det bara räknar levande virus.På så sätt kan sann antiviral effekt fastställas. Dessutom har denna teknik gjort det möjligt för oss att kvantifiera viral närvaro på fomiter och utforska effektiviteten av läkemedelsleverans från nya medicintekniska produkter inom vår sektor av herpesvirusforskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Virus för kvantifiering Viral funktion i alla skeden av genuttryck

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snabb molekylär detektion och differentiering av influensavirus A och B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...