Name: plaquing of herpes simplex viruses
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Laboratuvarlarımızdaki (PJD ve BJM) bu yöntemleri geliştiren yıllar boyunca bizimle birlikte çalışan sayısız öğrenciye teşekkür ederiz. Vesayeti altında bu metodolojinin ilk geliştirildiği Stan Person'a özel bir teşekkür. Bu çalışma kısmen Towson Üniversitesi Fisher Bilim ve Matematik Lisans Araştırma Destek Fonu ve NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264 tarafından desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Vero hücreleri ve canlı herpes virüsleri ile ilgili tüm prosedürler Towson Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu prosedürlerin genelleştirilmiş bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Vero hücrelerinin tohumlanması
<ol><li>Plak tahlilini başlatmadan bir gün önce, Vero hücrelerini tripsinize edin ve bunları normal Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamında (DMEM) yeniden askıya alın ...

<ol>
	<li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).</li><li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).</li><li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophage+particles:+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays.">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li><li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro;+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li><li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues.">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li><li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathology+of+virus+infections:+particular+reference+to+tissue+culture+studies.">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).</li><li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms:+An+update.">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li><li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li><li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+(Earle)+mouse+fibroblasts.">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li><li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation.">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li><li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2.">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li><li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory.">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li><li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells.">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li><li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells.">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li><li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-(ethylene+co-vinyl+acetate)+rings.">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63 (2006).</li><li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+counter:+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy.">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201 (2016).</li><li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen:+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen.">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li><li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses.">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li><li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells.">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li><li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+herpes+simplex+virus:+is+PCR+the+new+gold+standard.">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche.">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Method+of+'Right+and+Wrong+Cases'+(Constant+Stimuli)+without+Gauss's+formula.">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li><li>Ryu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).</li><li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus:+generation,+quantification,+propagation,+purification,+and+storage.">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2013).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+influenza+viruses.">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li><li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+purification,+and+titration.">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li><li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection.">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li></ol>

Plak tahlilleri neredeyse memeli hücre kültürünün kendisi kadar eski olsa da, her laboratuvarın bu temel tahlili yürütmek için kendi protokol setine sahip olduğu görülmektedir5,6,10,11,12,13,14,15,16,20</s...

Virüs plak tahlillerinin başlangıcı, 1890'larda virüslerin ilk keşiflerine kadar uzanır1. Tütün mozaik virüsü ilk önce izole edildi ve tütün yapraklarına geçti, burada bireysel enfeksiyon lekeleri, daha sonra virion2 olarak tanımlanan tek, canlı bir virüs varlığından2 kaynaklandığı ve ölçülebildi. Daha sonra bakteri ve bakteriyofajlarla yapılan seminal çalışmalar, büyümenin orta log fazındaki bakteriler, bakteriyofaj örneklerinin seri seyreltilmesi ve bakteri çimindeki gerçek deliklerin (adlandırılmış plaklar) daha sonra görselleştirilmesiyle üst agar da dahil olmak üzere bu virüsleri plak altına almak için kullanılan teknikleri mükemmelleştirmiştir3.
Hayvan virüslerinin yutulması, bakteriyofajlarla yapılan heyecan verici araştırmaların gerisinde kaldı, çünkü esas olarak kültürde memeli hücrelerinin yetiştirilmesi için gerekli yöntemler 1940'lara kadar geliştirilmedi4. Bununla birlikte, tüm konakçı organizmanın yokluğunda büyüyen murin hücrelerinin ortaya çıkışı4, virüsleri kültürleme ve sayma yeteneğinde yeni bir çağ yarattı. Bu tür çalışmalar, tavuk hücrelerinde Batı Atı Ensefalomiyelit virüsünün ve insan hücrelerinde poliovirüsün yayılması ve kantitasyonu için genişletilmiştir5,6. Kültürlenebilir memeli hücreleri alanı genişledikçe, çeşitli viral enfeksiyonlar için farklı konakçı hücrelerin kıskançlığı, dünyaya her türlü virüsü incelemek için bir dizi olanak sağladı7. Bu, insan herpes virüslerinin, özellikle de mukokutanöz lezyonlara neden olan herpes simpleks virüsü-1 (HSV-1) ve -2'nin (HSV-2) yayılmasını ve miktarını içeriyordu8. Önemli olarak, tüm plak tahlilleri, konakçı hücrelere bir numunede reseptör aracılı bir şekilde girebilen canlı viryonların varlığına bağlıdır9. Plaket tahlillerinin yürütülmesiyle ilgili yayınların yaygınlığı ve çokluğundan bağımsız olarak5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2 için bu yöntemler hem sanatın hem de bilimin bir karışımıdır; Protokoldeki her ayrıntıya dikkat edilmeden tahlil yapılamayacağı gibi, süreçteki incelik için kritikal bir göz olmadan da başarılı bir tahlil yapılamaz. Bu el yazması, HSV-1/-2 plak tahlilleri için en tutarlı tekrarlanabilir yöntemlerden birini, nadiren tartışılan tahlil sanatına yönelik kesin ayrıntılarla tasvir etmektedir.
Bu mevcut protokol, HSV-1 ve -2 için canlı plak oluşturan birimler (PFU) sayımlarını güvenilir bir şekilde elde eder. En iyi sonuçlar, düşük pasajda (pasaj numarası 155'in altında) Vero hücreleri (dönüştürülmüş Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücreleri) kullanılarak elde edilir ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), L-alanil-L-glutamin ve bir antibiyotik / antimikotik karışım ile desteklenmiş alfa-MEM17'de rutin olarak yetiştirilir18. Vero hücreleri, bu ortamda haftada iki ila üç kez, her seferinde 1/5 seyreltmede standart olarak çoğaltılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B2193214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (no Mg++ or Ca++)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>27-441-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quaternary agent (Lysol I.C.)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9645698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plaquing of herpes simplex viruses

Metodoloji için birincil literatürdeki referanslar da dahil olmak üzere, virüsleri rahatsız etmek için çok sayıda yayınlanmış protokol vardır. Bununla birlikte, virüsleri rahatsız etmek zor olabilir, bu da spesifikasyonlarına ve iyileştirilmesine odaklanmayı gerektirir. Yeni öğrencilerin ustalaşması için inanılmaz derecede zor bir yöntemdir, çünkü esas olarak en küçük ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Herpes simpleks virüslerini rahatsız etmenin bu gösterimi, yıllar boyunca yöntemi, özellikle nüanslarını görselleştirmekle mücadele edenlere yardımcı olmalıdır. Bu makale, standart plaquing metodolojisinin aynı ilkelerine dayanmakla birlikte, (1) işlem sırasında bozulmayı önlemek için konakçı hücrelerin en iyi nasıl ele alınacağı, (2) viryonların difüzyonunu sınırlamak için agarozdan daha kullanışlı bir viskoz ortam ve (3) güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir fiksasyon ve boyama prosedürünün ayrıntılı bir tanımını içermesi bakımından farklıdır. Ayrıca, eşlik eden video, başkalarına plak tahlilleri yapma talimatı verirken sıklıkla gözden kaçırılan süreçteki daha ince ayrımları göstermeye yardımcı olur.

Tablo 1'de en iyi sonuçları veren bir deneme gösterilmektedir. Tüm 10 kat seyreltmeler, plak sayılarında yaklaşık 10 kat azalmayı takip eder. Bu tür veriler, her üç kopya için de sayılabilir plak sayısının 10-4 aralığında düştüğü gerçek bir plak testi olan Şekil 2'de de görülebilir. Aynı şey, sayılabilir plak sayısının 10-3 seyreltmede olduğu en üst sıra olan Şekil 3'te de görülebili...

Watch this Scientific Journal Video about Plaquing of Herpes Simplex Viruses at JoVE.com

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Plaqueing, bir popülasyondaki canlı virüsleri ölçmek için kullanılan rutin bir yöntemdir. Plaqueing, bakteri ve bakteriyofajlarla çeşitli mikrobiyoloji müfredatlarında sıklıkla öğretilmesine rağmen, memeli virüslerinin veba edilmesi daha karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu protokol, herpes simpleks virüsleri ile düzenli çalışma için güvenilir bir şekilde çalışan prosedürleri açıklar.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokol, öğrencilerin bireysel enfeksiyonları net bir şekilde tanımlamasına ve tahlili kolayca yapmasına yardımcı olarak viral titreyi ölçmeyi daha verimli hale getirir. Bu protokol, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir sabitleme ve boyama prosedürü içerir. Bu yöntem, hastalıklara karşı antiviral tedavilerin doğruluğu ve etkinliği hakkında fikir verebilir.Bu veba protokolünün daha zor engelleri, hücrelerin işlem boyunca aşırı kalabalıklaşmamasını, kurumamasını veya çizilmemesini sağlayan tohumlama plakaları için hücre sayımlarıdır. Bu protokolün genel titiz doğasında da zorluklar yaşanabilir. Bununla birlikte, uygulama bu deneyin başarısının önemli bir katkısıdır.Başlamak için, bir laboratuvar oturumunda hücrelere virüs ilavesiyle numune seyreltmesini tamamlayın. PBS'de plak bulunan her virüs örneğini seri olarak seyreltin. En hassas izleme için genellikle 10 kat seyreltmeler kullanın.Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde tutun. Hücre kültürü ortamını bir pipet kullanarak bir veya iki kuyucuktan çıkarın. Seyreltilmiş virüs örneğini, her bir kuyucuğun kenarından damla damla her bir hücre katmanına damla damla dikkatlice ekleyin.Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar işlemi her bir veya iki kuyucuk için tekrarlayın. Tüm plakayı elle hafifçe sallayın. Daha sonra virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Her 10 dakikada bir, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir kuyucuğa daha eşit bir şekilde yaymak için yavaşça tekrar sallayın ve ardından inkübatöre geri yerleştirin. Emilmemiş inokulumu yanlışlıkla sayma olasılığını azaltmak için, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak virüs örneğini kuyucuklardan çıkarın ve numuneyi bir atık kabına atın. Plakaya 2,5 mililitre metilselüloz kaplama yerleştirin ve inkübatöre geri yerleştirin.Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak ağartıcı, iyodofor veya benzeri bir virüsit ilavesiyle dezenfekte edin. İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz bindirmeyi bir pipet kullanarak bir seferde bir veya iki kuyucuktan çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin. Her bir oyuğa% 50 etanol içinde yaklaşık iki mililitre% 1 kristal menekşe ekleyin.Tabağı, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla inkübe edin. Bu noktada, atık kabı daha önce gösterildiği gibi dezenfekte edin. Akış temizlenene kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.Her seyreltme serisindeki plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun. Şekil, plak sayılarında 10 kat azalmayı göstermektedir; burada sayılabilir plak sayısı, her üç kopya için 10'da eksi dört aralığına düşmüştür. Şekildeki ilk üç resim, eksi üç seyreltmeye kadar 10'daki plakları göstermektedir.Bununla birlikte, alt sıra, bir plak testi iyi yapılmadığında sonuçları gösterir. Vero hücrelerinin substrattan tamamen kalktığı üst kısımdaki görünür alanlarda herhangi bir seyreltmeden görülebilen çok az plak vardır. Benzer şekilde, bu şekil plak testi sırasında hücrelerin kuruması veya yanlış kullanımı ile ilgili sorunları göstermektedir.Bununla birlikte, bu rakam kritik olarak zayıf Vero hücresi tohumlamasını göstermektedir. Her kuyu, kuyu boyunca iyi yayılmamış ve kümeler halinde üst üste yığılmış hücrelerin göstergesi olan daha koyu mor lekeler gösterir. En iyi sonuçlar için, topaklanmış plakları önlemek için virüsün plaka boyunca eşit şekilde yayıldığından emin olun Plak tahlilleri diğer nicel yöntemlerden daha etkilidir, çünkü sadece canlı virüsü sayar.Bu şekilde, gerçek antiviral etkinlik oluşturulabilir. Ek olarak, bu teknik, fomitler üzerindeki viral varlığı ölçmemize ve herpes virüsü araştırması sektörümüzdeki yeni tıbbi cihazlardan ilaç dağıtımının etkinliğini keşfetmemize izin vermiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...