Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1669 (نقل الخلايا الليفية)، من قبل مؤسسة العلوم الروسية، منحة رقم 19-15-00425 (جميع الأعمال الأخرى على زراعة الخلايا الليفية في المختبر). وقد دعم جزئيا من قبل برنامج تطوير جامعة موسكو الحكومية لومونوسوف PNR5.13 (التصوير والتحليل). يعترف المؤلفون بدعم مركز نيكون للتميز في معهد أ. ن. بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية. نريد أن نقدم شكرنا الخاص لإيكاترينا تاران لمساعدتها في التمثيل الصوتي. كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للمركز الاتحادي للبحوث والسريرية للطب الفيزيائي والكيميائي للوكالة البيولوجية الطبية الاتحادية بتاريخ 08 سبتمبر 2015.
ملاحظة: الشكل 1 يعطي نظرة عامة على البروتوكول.
1. الحصول على ثقافة أساسية من الخلايا...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

يمكن الحصول على نتائج أفضل جودة لتحليل ديناميكيات microtubules من صور مجهرية عالية الجودة. من المهم مراقبة جميع الشروط اللازمة لتصوير الخلايا الحية بفارق زمني وضبط معلمات التصوير بشكل صحيح. استخدام أطباق خاصة ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج (أطباق confocal) مهم، لأن الزجاج لديه مؤشر الانكسار مختلفة من ...

مرض هنتنغتون (HD) هو مرض تنكسي عصبي غير قابل للشفاء ناجم عن بروتين ترميز الجينات الطفرة (HTT). ويرتبط HTT في المقام الأول مع الحويصلات والبيبوليتولات الصغيرة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule1،2. لدراسة تأثير HTT متحولة على ديناميات microtubule، استخدمنا في التصور المختبري للبروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي. لتحميل الفلورسنت المسمى EB3 في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم تطبيق التراتوفيكيد البلازميد. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية التي تم الحصول عليها من خزعة جلد المرضى عالية الدقة لهذه الدراسة.
الطفرة في الجين البروتين HTT يؤدي إلى استطالة من البوليglutamine المسالك3. HTT له دور في عمليات خلوية مثل الغدد الصماء4، نقل الخلية1،2، تدهور البروتين5، إلخ. جزء كبير من هذه العمليات ينطوي على عناصر مختلفة من الهيكل الخلوي الخلية، بما في ذلك microtubules.
الخلايا الأولية البشرية هي أفضل نموذج لإعادة إنتاج الأحداث التي تحدث في خلايا المريض عن كثب قدر الإمكان. لإنشاء مثل هذه النماذج ، يحتاج المرء إلى عزل الخلايا عن مواد الخزعة البشرية (على سبيل المثال ، من العينات الجراحية). خط الخلية الأولية الناتجة مناسبة لدراسة الإمراض باستخدام مختلف الأساليب الوراثية والكيميائية الحيوية والجزيئية وبيولوجيا الخلايا. أيضا، ثقافات الخلايا الأولية البشرية بمثابة مقدمة لخلق مختلف الثقافات المتحولة وراثيا ومحورةوراثيا 6.
ومع ذلك ، على النقيض من ثقافات الخلايا الخالدة ، فإن العيب الكبير للخلايا الأولية هو قدرتها المحدودة على المرور. لذلك، نوصي باستخدام الخلايا في مرحلة الممرات المبكرة (حتى 15). الثقافات القديمة تتدهور بسرعة كبيرة، وتفقد خصائصها الفريدة. وبالتالي، ينبغي الاحتفاظ الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها حديثا المجمدة للتخزين على المدى الطويل.
ثقافات الخلايا الأولية عرضة لظروف الزراعة. ولذلك، فإنها غالبا ما تتطلب نهجا فريدة من نوعها والاستفادة المثلى من ظروف النمو. على وجه الخصوص ، فإن الخلايا الليفية الأولية للبشرة البشرية المستخدمة في تجاربنا تتطلب على الركيزة. ومن ثم، استخدمنا مختلف الطلاء إضافية (على سبيل المثال، الجيلاتين أو فيبروكتين) اعتمادا على نوع التجربة.
يحدد الهيكل الخلوي الخلوي شكل الخلية وحركتها وحركتها. ديناميات الهيكل الخلوي حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات داخل الخلايا على حد سواء في مرحلة ما بين المراحل والميتوسيس. على وجه الخصوص، والهيكل الخلوي بوليمر من توبولين، هي هياكل ديناميكية للغاية والقطبية، وتمكين النقل الحركي بوساطة البروتين الموجهة داخل الخلايا. نهايات microtubules هي في إعادة ترتيب مستمر، مراحل التجميع الخاصة بهم بالتناوب مع مراحل التفكيك، وهذا السلوك يسمى "عدم الاستقرار الديناميكي"7،8،9. تحول البروتينات المختلفة المرتبطة بها توازن تفاعل البلمرة ، مما يؤدي إما إلى تكوين البوليمر أو تكوين مونومر البروتين. إضافة وحدات توبولين الفرعية يحدث أساسا في نهاية زائد من microtubules10. تتكون عائلة البروتينات الملزمة النهائية (EB) من ثلاثة أعضاء: EB1 و EB2 و EB3. أنها بمثابة زائد نهاية تتبع البروتينات (+TIPs) وتنظيم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي11.
تستخدم العديد من الدراسات الفلورسنت المسمى جزيء أنبوبولين microinjection أو العدوى مع التصوير الفاصل الزمني وتحليل الفيديو لتصور microtubules في المختبر. قد تكون هذه الطرق الغازية والضارة للخلايا، وخاصة الخلايا البشرية الأولية. الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف لإصابة الخلايا. حاولنا الوصول إلى أعلى مستوى ممكن من العدوى دون التأثير على الجدوى ومورفولوجيا الخلايا الأصلية. تطبق هذه الدراسة الطريقة الكلاسيكية لدراسة الاختلافات في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلدية من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون من مرض هنتنغتون.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Transfection مع بروتين علامة المسمى fluorescently من الفائدة في تركيبة مع المجهر الفيديو الفاصل الزمني هو وسيلة كلاسيكية لدراسة الخصائص الديناميكية للهيكل الخلوي. يقدم هذا البروتوكول تقنية لإصابة الإنسان بالخلايا الليفية الأولية ، والتي يمكن أن تكون صعبة بسبب تفاصيل ظروف زراعة الخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الهيكل الخلوي صيانة الممتلكات الحيوية مستوى منخفض من العدوى للحصول على نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء دون التسبب في استقرار microtubule. من المهم اتخاذ تدابير لحماية الخلايا من الإجهاد الناجم عن الضوء وتلاشي الصبغة الفلورية. في سياق عملنا، اختبرنا طرق وبروتوكولات مختلفة للإصابة وكذلك ناقلات مختلفة لاختيار أفضل مزيج من الشروط المناسبة لدراسات الورم الليفي الأولي للإنسان. قمنا بتحليل مقاطع الفيديو الناتجة عن الفاصل الزمني وديناميكيات microtubule المحسوبة باستخدام ImageJ. ديناميات microtubules 'زائد ينتهي في أجزاء الخلية المختلفة ليست متشابهة ، لذلك قسمنا التحليل إلى مجموعات فرعية -- المنطقة المركزية ، ولاميلا ، وذيل الخلايا الليفية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه للتحليل المختبري لديناميكيات الهيكل الخلوي في عينات المرضى ، مما يتيح الخطوة التالية نحو فهم ديناميكيات تطور المرض المختلفة.

توضح أفلام GFP-EB3 الناتجة التي تم إنتاجها باستخدام البروتوكول(الشكل 1)الخصائص الديناميكية للبيبات الدقيقة. وتشارك Microtubules في عمليات الخلايا المختلفة، وخصائصها الحيوية تؤثر على مختلف خصائص الحياة من ثقافة الخلية البشرية الأولية من المواد خزعة المرضى(الشكل 2)....

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

هذا البروتوكول مخصص للتصور microtubule زائد نهاية بواسطة EB3 البروتين transfection لدراسة خصائصها الحيوية في ثقافة الخلايا الأولية. تم تنفيذ البروتوكول على الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية التي تم الحصول عليها من مرضى مرض هنتنغتون.

Microtubule زائد نهاية ديناميات التصور في نموذج مرض هنتنغتون على أساس الخلايا الليفية الجلد الأساسية البشرية

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

مرض هنتنغتون، HD، هو مرض غير قابل للشفاء، التنكسية العصبية الناجمة عن طفرة في بروتين هنتنغتين ترميز الجينات. ويرتبط هنتنغتين في المقام الأول مع الحويصلات والبيبولا الدقيقة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule. لدراسة تأثير هنتنغتين متحولة على دينامية microtubules، استخدمنا في التصور في الجسم الحي من البروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية للmicrotubules عن طريق الانحناء وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي.لتحميل EB3 المسمى الفلوري في الخلايا الليفية للبشرة البشرية ، طبقنا العدوى البلازمية. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية للحصول على خزعة الجلد للمريض EB3 لهذه الدراسة. قم بتوصيل الخزعة إلى المختبر في غضون ساعات قليلة في المتوسط DMEM ، مع تكملة 15 ميكروغرام لكل ملليلتر من البنسلين ، و 50 وحدة لكل ملليلتر من الستربتومايسين.ضع أنسجة الخزعة في طبق بيتري طوله ستة سنتيمترات، مع كمية صغيرة من الوسط. باستخدام مشرط معقم، قطع عينة الخزعة إلى قطع حوالي 0.5 إلى ملليمتر واحد في الحجم. ضع واحدا، اثنان، تم الحصول على شظايا في طبق بيتري طوله 3.5 سنتيمتر، وضع زلة غطاء معقم فوق قطع الخزعة.أضف ببطء 1.5 ملليلتر من وسيط النمو. الألياف الألياف في المتوسط النمو في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، في 5٪ CO2 وهذا هو سبعة مئوية، 80٪ الرطوبة. بعد أربعة أو سبعة أيام ، تبدأ الخلايا القرنية الأولى ، ثم تبدأ الخلايا الليفية في الهجرة من الأنسجة إلى أسفل الطبق.زراعة الخلايا. لتصور transfection، والزجاج أطباق لوحة confocal، ينبغي استخدام أطباق confocal. تغطية أسفل الطبق مع محلول الجيلاتين autoclaved 0.1٪إعدادها في الماء المقطر.حضانة لمدة 15 دقيقة. إعداد وسيط الثقافة. تخلط جيدا، وتخزين طويل القامة في زائد 4 مئوية.قم بتدفئة الوسط إلى زائد 37 درجة مئوية، قبل إضافته إلى الخلايا. تقييم الثقافة تحت المجهر. إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع DPBS معقمة.إضافة ملليلتر واحد من محلول 0.25٪trypsin قبل الحارة إلى الخلايا. تحقق من الخلايا تحت المجهر إذا كانت تنفصل عن الركيزة تماما. إلغاء تنشيط التريبسين مع ملليلتر واحد من وسيطة الثقافة.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. طرد مركزي الأنبوب في 200 G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، resuspend لوحة الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الثقافة.عد رقم الخلية. حساب العدد المطلوب من الخلايا. إزالة البذور لهم مع كثافة من ثمانية إلى 15، مضروبا في 10 إلى قوة ثلاثة، مرت بسنتيمتر.يتم تحريك هذا إلى ملليلترات من وسيط الثقافة. إزالة محلول الجيلاتين من طبق الثقافة المعدة للتلقيح، وإضافة على الفور اثنين من ملليلتر من تعليق الخلية. زراعة الخلايا الليفية في زائد 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.تحديث المتوسطة كل يومين أو أربعة أيام. للتجارب، استخدم خلايا أربعة أو 11 مقطعا. بحلول وقت العدوى ، يجب ألا يزيد الالتقاء عن 70 ، 80٪ استبدال الوسط الثقافي بواحدة طازجة قبل 24 ساعة من العدوى.إعداد مجمع الحمض النووي الدهون، استنادا إلى مساحة وكثافة بذر الخلية. تم استخدام عامل العدوى الليبووسومية ، وكثافة بذر الخلية واحد ، مضروبا في 10 إلى قوة أربع خلايا ، مرت بسنتيمتر. أضف ثلاثة ميكرولترات من الكاشف التجاري إلى 125 ميكرولتر من Opti-MEM ، والتي لا تحتوي على مضادات حيوية.دون لمس جدران الأنبوب، وإعادة الإنفاق بلطف. تمييع الحمض النووي البلازميد، GFP-EB3، إضافة ميكروغرام واحد من الحمض النووي البلازميد إلى 125 ميكرولتر من OptiMEM. إعادة الإنفاق بلطف.إضافة الحمض النووي البلازميد المخفف إلى كل أنبوب من كاشف العدوى المخفف، نسبة واحدة إلى واحدة. حضانة لمدة 30 دقيقة. أضف مجمع الدهون في الحمض النووي إلى طبق بيتري الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات مع الخلايا.تخلط مع أرجوحة الصليبية لمدة 30 ثانية. احتضان الخلايا مع عامل العدوى لمدة 24 ساعة، ثم تغيير المتوسطة إلى واحدة جديدة. تحليل الكفاءة بعد التفتيش في 24 و 48 ساعة.التحضير للتصوير. قبل التصوير الحي للخلايا، قم بتغيير وسيط الثقافة إلى وسط دون صبغة مؤشر PH لتقليل الفلورة الذاتية. تطبيق الزيوت المعدنية بعناية على مرحلة الخلية المتوسطة لتغطية تماما المتوسطة، وعزلها عن البيئة الخارجية للحد من اختراق O2، والتبخر المتوسط.استخدم مصباح ماكرو وكل الصور في عدسة موضوعية ذات 60 ضعفا و100 مرة مع فتحة أرقام عالية لالتقاط الصورة. بالنسبة للملاحظات viva ، يجب أن يكون المجهر مجهزا وحاضنة للحفاظ على الظروف اللازمة للخلايا ، بما في ذلك ضرب الطاولة البصرية ، والعدسة لتمرير 37 مئوية ، وكانت الغرفة المغلقة هي إمدادات ثاني أكسيد الكربون ، والدعم على مستوى الرطوبة. ضع طبق الكونفوجكال مع الخلايا في حامل المجهر قبل التصوير.تأكد من أن الطبق والكاميرا متصلان بشكل آمن بحامل الحامل لتجنب الانجراف أثناء التقاط الصور. تعيين معلمات التصوير. اختر قيم التعرض المنخفضة ، لأن الشريحة تحفز على إتلاف الخلايا ، يتفاعل مع مساحات الأكسجين.لدراسة ديناميات microtubules في الخلايا الليفية الجلد البشري، اخترنا التعرض 300 مللي ثانية. التركيز على الهدف من الاهتمام. لفترة طويلة ، والتصوير الفاصل الزمني ، ونظام تثبيت التركيز التلقائي ، ونظام التركيز المثالي ضروري ، لأنه قد يكون هناك تحول على طول محور المجموعة ، وبالتالي فإن الهدف من الاهتمام سيكون خارج التركيز.اختر ظروف التصوير المثالية، اعتمادا على حساسية الخلية للضوء، ومعدل تلاشي الكروم المضيئة. وبما أن الهياكل الدقيقة هي هياكل ديناميكية للغاية، فيمكن اختيار وقت قصير إلى حد معقول، ويجب أن يكون معدل الإطار مرتفعا بما فيه الكفاية. للتحقيق في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلد، استخدمنا تردد إطار واحد في الثانية الواحدة، لمدة ثلاث أو خمس دقائق.عند تحديد الكائن التالي للحصول على صورة ، ابتعد عن المنطقة المصورة بالفعل ، نظرا لأنه تحت تأثير الضوء ، هناك نزيف صور قابل للانقضاء. منذ استخدمنا تردد التصوير عالية نسبيا، مصراع الكاميرا لم يغلق بين الصور، وكان المصباح في وقت متأخر عن فترة كاملة من التصوير، والتي تتلاشى زيادة. اختر مقاطع الفيديو المثلى لدراسة ديناميكيات microtubule بصريا ، مع الأخذ في الاعتبار جودة العدوى ، وجودة صور microtubules ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى ، وعدم الانجراف للخلية المحللة.استخدم مقاطع الفيديو المختارة لدراسة ديناميكيات microtubules بالإضافة إلى النهايات ، عن طريق ربطها في برنامج فيجي. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي العدوى ، وضمان التعبير عن البروتين الكافي. نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء ، لا photobleaching من microtubules ، وعدم وجود خلية الانجراف حاسمة للتصوير.في التصور في الجسم الحي من ديناميات microtubule يوفر معلومات حيوية عن خصائص هنتنغتين متحولة. يمكن تطبيق بروتوكولنا على دراسات الأمراض الأخرى ، التي ينطوي علم الأمراض على خصائص ديناميكية للهيكل الخلوي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

جلد كامل عيب نموذج في تقييم الأوعية الدموية من الحيوية<em&gt; في فيفو</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...