Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse i Den Russiske Føderation, tilskud nr. 075-15-2019-1669 (transfection af fibroblaster), af Den Russiske Videnskabsfond, tilskud nr. 19-15-00425 (alle andre værker om dyrkning af fibroblaster in vitro). Det blev delvist støttet af Lomonosov Moskva State University Development program PNR5.13 (billedbehandling og analyse). Forfatterne anerkender støtte fra Nikon Center of Excellence på A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi ønsker at tilbyde vores særlige tak til Ekaterina Taran for hendes hjælp med stemmeskuespil. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjælp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet blev skabt med BioRender.com.

Denne protokol følger retningslinjerne fra Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency dateret september 08, 2015.
BEMÆRK: Figur 1 giver et overblik over protokollen.
1. Opnåelse af en primær kultur af human hud fibroblaster (Figur 2)
<ol><li>Levere biopsien til et laboratorium inden for få timer i Dulbecco'...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Bedre kvalitetsresultater til mikrotubules dynamikanalyse kan fås fra mikroskopiske billeder af høj kvalitet. Det er vigtigt at overholde alle de nødvendige betingelser for time-lapse imaging af levende celler og at justere billeddannelsesparametrene korrekt. Brug af specielle cellekulturretter med en glasbund (konfokale retter) er vigtigt, da glas har et andet brydningsindeks for lys end plast. Tykkelsen af glasset og dets ensartethed over hele dets område er også ekstremt vigtigt, da disse parametre er afgørende ...

Huntingtons Sygdom (HS) er en uhelbredelig neurodegenerativ patologi forårsaget af et mutationsgenkodningsjægerprotein (HTT). HTT er primært forbundet med vesikler og mikrotubuler og er sandsynligvis involveret i mikrotubuleafhængige transportprocesser1,2. For at studere indflydelsen af mutant HTT på mikrotubuledynamikken brugte vi in vitro-visualiseringen af EB3-proteinet, der regulerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber ved at binde og stabilisere de voksende plus-ends. For at indlæse fluorescerende mærket EB3 i human hud fibroblaster, plasmid transfection blev anvendt. Vi brugte den primære fibroblastkultur, der blev opnået fra HS-patienternes hudbiopsi, til denne undersøgelse.
Mutationen i HTT-proteingenet fører til forlængelse af polyglutaminkanalen3. HTT har en rolle i sådanne cellulære processer som endokytose4, celletransport1,2, proteinforringelse5osv. Væsentlig del af disse processer involverer forskellige elementer i cellen cytoskeleton, herunder mikrotubuler.
Menneskelige primære celler er den bedste model til at reproducere hændelser, der forekommer i patientceller så tæt som muligt. For at skabe sådanne modeller skal man isolere celler fra humant biopsimateriale (f.eks. fra kirurgiske prøver). Den resulterende primære cellelinje er egnet til at studere patogenese ved hjælp af forskellige genetiske, biokemiske, molekylære og cellebiologiske metoder. Også menneskelige primære cellekulturer tjener som en forløber for at skabe forskellige transdifferentierede og transgene kulturer6.
Men i modsætning til udødeliggjorte cellekulturer er den betydelige ulempe ved primære celler deres begrænsede passagekapacitet. Derfor anbefaler vi at bruge celler i de tidlige passager fase (op til 15). Ældre kulturer degenererer meget hurtigt og mister deres unikke egenskaber. Således bør de nyerhvervede primære celler holdes frosne til langtidsopbevaring.
Primære cellekulturer er modtagelige for dyrkningsforhold. Derfor kræver de ofte unikke tilgange og optimering af vækstbetingelser. Især er den menneskelige hud primære fibroblaster, der anvendes i vores eksperimenter krævende på substratet. Derfor brugte vi forskellige ekstra belægninger (f.eks. gelatine eller fibronectin) afhængigt af eksperimenttypen.
Cellen cytoskeleton bestemmer celleform, mobilitet og bevægelse. Dynamikken i cytoskeleton er afgørende for mange intracellulære processer både i interfase og mitose. Især cytoskeleton polymeriseret fra tubulin, er meget dynamiske og polære strukturer, der muliggør motor protein-medieret rettet intracellulær transport. Mikrotubulernes ender er i konstant omlejring, deres samlingsfaser veksler med demonteringsfaserne, og denne funktionsmåde kaldes "dynamisk ustabilitet"7,8,9. Forskellige tilknyttede proteiner flytter ligevægten i polymeriseringsreaktionen, hvilket fører enten til polymerdannelsen eller proteinmonomerdannelsen. Tilsætning af tubulinunderenheder forekommer hovedsageligt i plus-enden af mikrotubuler10. Den endelige-bindende (EB) proteiner familie består af tre medlemmer: EB1, EB2, og EB3. De tjener som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) og regulerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber ved at binde og stabilisere deres voksende plus-ends11.
Mange undersøgelser bruger fluorescerende molekyle-mærket tubulin mikroinjection eller transfection med time-lapse imaging og video analyse til at visualisere mikrotubules in vitro. Disse metoder kan være invasive og skadelige for celler, især primære menneskelige celler. Det mest udfordrende skridt er at finde betingelser for celletransfekt. Vi forsøgte at nå det højest mulige niveau af transfection uden at påvirke levedygtigheden og native cellemorfologi. Denne undersøgelse anvender den klassiske metode til at studere forskellene i mikrotubuledynamikken i hudfibroblaster hos raske donorer og patienter med Huntingtons Sygdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Transfection med et fluorescerende mærket markørprotein af interesse i kombination med time-lapse videomikroskopi er en klassisk metode til at studere cytoskeletons dynamiske egenskaber. Denne protokol tilbyder en teknik til human primær fibroblast transfection, som kan være vanskeligt på grund af detaljerne i primære celle dyrkning betingelser. Derudover kræver cytoskeleton dynamisk ejendomsvedligeholdelse et lavt niveau af transfection for at opnå et godt signal-til-støj-forhold uden at forårsage mikrotubulestabilisering. Det er vigtigt at træffe foranstaltninger til at beskytte cellerne mod lys-induceret stress og fluorescerende farvestof fading. I løbet af vores arbejde testede vi forskellige transfection metoder og protokoller samt forskellige vektorer for at vælge den bedste kombination af betingelser egnet til humane primære fibroblast undersøgelser. Vi analyserede de resulterende time-lapse videoer og beregnet microtubule dynamik ved hjælp af ImageJ. Dynamikken i mikrotubules plus-enderne i de forskellige celledele er ikke ens, så vi opdelte analysen i undergrupper - centrosome-regionen, lamellaen og halen af fibroblaster. Især kan denne protokol bruges til in vitro-analyse af cytoskeleton dynamik i patientprøver, hvilket gør det muligt for det næste skridt i retning af at forstå dynamikken i de forskellige sygdomsudvikling.

De resulterende GFP-EB3-film, der er produceret ved hjælp af protokollen (Figur 1), illustrerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber. Mikrotubuler er involveret i forskellige celleprocesser, og deres dynamiske egenskaber påvirker forskellige livskarakteristika i den primære menneskelige cellekultur fra patienternes biopsimateriale (Figur 2).
Følgende parametre bestemmer mikrotubulernes dynamiske ustabilitet: vækstraterne (polymer...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Denne protokol er dedikeret til microtubule plus-end visualisering af EB3 protein transfection at studere deres dynamiske egenskaber i primær cellekultur. Protokollen blev implementeret på humane primære hudfibroblaster fra patienter med Huntingtons Sygdom.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualisering i Huntingtons Sygdom Model baseret på Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Huntingtons Sygdom, HS, er en uhelbredelig, neurodegenerativ patologi forårsaget af en mutation i genkodning af huntingtinprotein. Huntingtinen er primært forbundet med vesikler og mikrotubuler og sandsynligvis involveret i mikrotubuleafhængige transportprocesser. For at studere indflydelsen af mutant huntingtin på dynamikken i mikrotubuler brugte vi in vivo visualisering af EB3 protein, som regulerer mikrotubules dynamiske egenskaber ved at bøje og stabilisere de voksende plus-ends.For at indlæse fluorescerende mærket EB3 i menneskelige hud fibroblaster, vi anvendt plasmid transfection. Vi brugte den primære fibroblastkultur til at få fra EB3-patientens hudbiopsi til denne undersøgelse. Levere biopsi til laboratoriet inden for et par timer i DMEM medium, suppleret med 15 mikrogram per milliliter penicillin, og 50 enheder per milliliter af streptomycin.Placer biopsi væv i en seks centimeter Petriskål, sammen med en lille mængde medium. Ved hjælp af en steril skalpel skæres biopsiprøven i stykker omkring 0,5 til en millimeter i størrelse. Placer en, to, opnåede fragmenter i en 3,5 centimeter Petriskål, og læg et sterilt dæksel glide over biopsistykkerne.Tilsæt langsomt 1,5 milliliter af et vækstmedium. Kultur fiberblaster i vækstmediet i en CO2-inkubator, i 5% CO2, der er syv Celsius, 80% fugtighed. Efter fire, syv dage, først keratinocytter, så fibroblaster begynder at migrere fra vævet til bunden af skålen.Celledyrkning. Til transfection visualisering, glas konfokale plade retter, konfokale retter bør anvendes. Dæk fadbunden med autoklavet 0,1% gelatineopløsning tilberedt i destillatvand.Inkuber i 15 minutter. Forbered kulturmediet. Bland grundigt, opbevare høj på plus 4 Centigrade.Varm mediet til plus 37 Centigrade, før du tilføjer til cellerne. Vurder kulturen under mikroskopet. Fjern mediet, og vask cellerne med en steril DPBS.Tilsæt en milliliter forvarmet 0,25% trypsinopløsning til cellerne. Kontroller cellerne under mikroskopet, hvis de løsner sig helt fra substratet. Deaktiver trypsin med en milliliter af kulturmediet.Overfør celleaffjedringen til et 15 milliliter konisk rør. Centrifugere røret ved 200 G i fem minutter. Fjern supernatanten, genbrug cellepaletten i en milliliter af kulturmediet.Tæl cellenummeret. Beregn det nødvendige antal celler. De-frø dem med en tæthed på otte til 15, ganget med 10 til magt tre, passeret med en centimeter.Dette er panoreret i milliliter af kulturmediet. Fjern gelatineopløsningen fra kulturskålen, der er forberedt til podning, og tilsæt straks to milliliter af celleaffjedringen. Dyrk fibroblaster ved plus 37 Centigrade i en CO2-inkubator.Opdater mediet hver anden, fjerde dag. Til eksperimenter skal du bruge cellerne i fire, 11 passager. På tidspunktet for transfection bør sammenløbet ikke være mere end 70, 80% Udskift kulturmediet med en frisk 24 timer før transfektion.Forbered et DNA-lipid kompleks, baseret på området og tætheden af celle såning. Fedtmulsomaltransfekt, og tætheden af celle såning af en, ganget med 10 til kraften i fire celler, passeret med en centimeter blev brugt. Tilføj tre mikroliter af kommercielt reagens til 125 mikroliter opti-MEM, der ikke indeholder antibiotika.Uden at røre rørvæggene, forsigtigt genbruges. Fortynd plasmid DNA, GFP-EB3, tilføjer et mikrogram af plasmid DNA til 125 mikroliter af OptiMEM. Forsigtigt genbruges.Tilsæt fortyndet plasmid DNA til hvert rør af fortyndet transfection reagens, et til et forhold. Inkuber i 30 minutter. Tilsæt DNA lipid komplekset til de seks centimeter Petriskål med celler.Bland med en korsformet sving i 30 sekunder. Inkuber celler med et transfektionsmiddel i 24 timer, og skift derefter mediet til frisk. Analyser effektiviteten efter inspektion om 24 og 48 timer.Forbereder sig til billeddannelse. Før levende billeddannelse af celler, ændre kulturmediet til et medium uden PH indikator farvestof for at reducere autofluorescence. Påfør forsigtigt mineralsk olie på mediumcellefasen for helt at dække mediet og isolere det fra det ydre miljø for at reducere O2-indtrængningen og medium fordampning.Brug en makrolampe og hele billedet i 60-fold, 100-fold objektiv linse med høj tal blænde til at tage billede. For in viva observationer skal mikroskopet være udstyret med en inkubator for at opretholde de nødvendige betingelser for cellerne, herunder at ramme det optiske bord, og linsen til at passere 37 Celsius, et lukket kammer var CO2-forsyning og fugtighedsniveaustøtte. Placer den konfokale skål med cellerne i holderen af mikroskopet før billeddannelse.Sørg for, at fadet og kameraet er forsvarligt fastgjort til holderen for at undgå at drive, mens du tager billeder. Indstilling af billedparametrene. Vælg de lave eksponeringsværdier, da dias inducerer celleskadende, reagerer med iltrum.For at studere dynamikken i mikrotubuler i human hud fibroblaster, valgte vi en 300 millisekunder eksponering. Fokuser på genstanden for interesse. For lang tid, time-lapse imaging, den automatiske fokus stabilisering system, perfekt fokus system er nødvendig, da der kan være et skift langs den indstillede akse, og genstand for interesse vil således være ude af fokus.Vælg de optimale billeddannelsesforhold, afhængigt af cellens lysfølsomhed, og hastigheden af flare chrome fading. Da mikrotubuler er meget dynamiske strukturer, kan der vælges rimelig kort tid igen, og billedhastigheden skal være tilstrækkelig høj. For at undersøge mikrotubule dynamikken i huden fibroblaster, vi brugte en frekvens på en ramme i sekundet, i tre, fem minutter.Når du vælger det næste objekt for at få billede, skal du flytte væk fra det allerede afbildede område, da der under påvirkning af lys er en elapsbar fotoblødning. Da vi brugte en relativt høj billedfrekvens, lukkede lukkeren ikke mellem billeder, og lampen var forsinket i hele billeddannelsesperioden, hvilket falmer øget. Vælg de optimale videoer til at studere mikrotubuledynamikken visuelt under hensyntagen til transfectionens kvalitet, kvaliteten af mikrotubulernes billeder, optimalt signal-til-støj-forhold og fraværet af drifting af analyseret celle.Brug de valgte videoer til at studere mikrotubulerne plus-enderne dynamik, ved trussing dem i Fiji-programmet. Det mest kritiske skridt i protokollen er transfection, hvilket sikrer tilstrækkeligt proteinudtryk. Godt signal-til-støj-forhold, ingen fotobleaching af mikrotubuler og fravær af celledrift er afgørende for billeddannelse.In vivo visualisering af microtubule dynamik giver vigtige oplysninger om egenskaberne af mutant huntingtin. Vores protokol kan anvendes til undersøgelser af andre sygdomme, hvis patologi implicerer dynamiske egenskaber cytoskeleton.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-tidsmæssige Manipulation af Lille GTPase aktivitet på Subcellulær niveau og på Tidsplan for Seconds i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En fuld huddefekten model til evaluering Vaskularisering biomaterialer<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Mikrofluidapparat Flow Afdeling Model for trombocytinfusion og Hæmostase Måler blodpladeaflejring og fibrindannelse i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...