Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Cette recherche a été financée par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention n ° 075-15-2019-1669 (transfection de fibroblastes), par la Fondation russe pour la science, subvention n ° 19-15-00425 (tous les autres travaux sur la culture de fibroblastes in vitro). Il a été partiellement soutenu par le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou PNR5.13 (imagerie et analyse). Les auteurs reconnaissent le soutien du Centre d’excellence Nikon de l’Institut de biologie physico-chimique A. N. Belozersky. Nous tenons à remercier tout particulièrement Ekaterina Taran pour son aide en doublage. Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.

Ce protocole suit les directives du Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine de la Federal Medical Biological Agency datées du 8 septembre 2015.
REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole.
1. Obtention d’une culture primaire de fibroblastes cutanés humains (Figure 2)
<ol><li>Administrer la biopsie à un laboratoire en quelques heure...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Des résultats de meilleure qualité pour l’analyse de la dynamique des microtubules peuvent être obtenus à partir d’images microscopiques de haute qualité. Il est important d’observer toutes les conditions nécessaires à l’imagerie time-lapse des cellules vivantes et d’ajuster correctement les paramètres d’imagerie. L’utilisation de plats de culture cellulaire spéciaux avec un fond en verre (plats confocaux) est importante, car le verre a un indice de réfraction de la lumière différent de celui du...

La maladie de Huntington (MH) est une pathologie neurodégénérative incurable causée par un gène mutationnaire codant pour la protéine de lahuntingtine (HTT). HTT est principalement associé aux vésicules et aux microtubules et est probablement impliqué dans les processus de transport dépendants des microtubules1,2. Pour étudier l’influence de l’HTT mutant sur la dynamique des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vitro de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en liant et en stabilisant les extrémités plus en croissance. Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, une transfection plasmidique a été appliquée. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes obtenue à partir de la biopsie cutanée des patients MH pour cette étude.
La mutation du gène de la protéine HTT entraîne l’allongement du tractus de la polyglutamine3. HTT a un rôle dans des processus cellulaires tels que l’endocytose4, le transport cellulaire1,2, la dégradation des protéines5, etc. Une partie substantielle de ces processus implique divers éléments du cytosquelette cellulaire, y compris les microtubules.
Les cellules primaires humaines sont le meilleur modèle pour reproduire le plus fidèlement possible les événements qui se produisent dans les cellules des patients. Pour créer de tels modèles, il faut isoler des cellules à partir de matériel de biopsie humaine (par exemple, à partir d’échantillons chirurgicaux). La lignée cellulaire primaire résultante convient à l’étude de la pathogenèse à l’aide de diverses méthodes génétiques, biochimiques, moléculaires et de biologie cellulaire. En outre, les cultures de cellules primaires humaines servent de précurseur pour la création de diverses cultures transdifférenciées ettransgéniques 6.
Cependant, contrairement aux cultures cellulaires immortalisées, l’inconvénient significatif des cellules primaires est leur capacité de passage limitée. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des cellules au stade des premiers passages (jusqu’à 15). Les cultures plus anciennes dégénèrent très rapidement, perdant leurs propriétés uniques. Ainsi, les cellules primaires nouvellement obtenues doivent être conservées congelées pour un stockage à long terme.
Les cultures cellulaires primaires sont sensibles aux conditions de culture. Par conséquent, ils nécessitent souvent des approches uniques et une optimisation des conditions de croissance. En particulier, les fibroblastes primaires de la peau humaine utilisés dans nos expériences sont exigeants sur le substrat. Par conséquent, nous avons utilisé divers revêtements supplémentaires (par exemple, de la gélatine ou de la fibronectine) en fonction du type d’expérience.
Le cytosquelette cellulaire détermine la forme, la mobilité et la locomotion de la cellule. La dynamique du cytosquelette est cruciale pour de nombreux processus intracellulaires à la fois dans l’interphase et la mitose. En particulier, les cytosquelettes polymérisés à partir de la tubuline sont des structures hautement dynamiques et polaires, permettant un transport intracellulaire dirigé médié par les protéines motrices. Les extrémités des microtubules sont en réarrangement constant, leurs phases d’assemblage alternent avec les phases de démontage, et ce comportement est appelé « instabilité dynamique »7,8,9. Diverses protéines associées modifient l’équilibre de la réaction de polymérisation, conduisant soit à la formation de polymères, soit à la formation de monomères protéiques. L’ajout de sous-unités de tubuline se produit principalement à l’extrémité supérieure des microtubules10. La famille des protéines de liaison terminale (EB) se compose de trois membres : EB1, EB2 et EB3. Ils servent de protéines de suivi des extrémités plus (+TIP) et régulent les propriétés dynamiques des microtubules en se liant et en stabilisant leurs extrémités supérieures en croissance11.
De nombreuses études utilisent la micro-injection ou la transfection de tubuline marquée par molécule fluorescente avec imagerie time-lapse et analyse vidéo pour visualiser les microtubules in vitro. Ces méthodes peuvent être invasives et nocives pour les cellules, en particulier les cellules humaines primaires. L’étape la plus difficile consiste à trouver les conditions de transfection cellulaire. Nous avons essayé d’atteindre le plus haut niveau possible de transfection sans affecter la viabilité et la morphologie cellulaire native. Cette étude applique la méthode classique pour étudier les différences dans la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés de donneurs sains et de patients atteints de la maladie de Huntington.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

La transfection avec une protéine marqueur d’intérêt marquée par fluorescence en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse est une méthode classique d’étude des propriétés dynamiques du cytosquelette. Ce protocole offre une technique de transfection des fibroblastes primaires humains, ce qui peut être difficile en raison des spécificités des conditions de culture cellulaire primaire. De plus, le maintien des propriétés dynamiques du cytosquelette nécessite un faible niveau de transfection pour obtenir un bon rapport signal/bruit sans provoquer de stabilisation des microtubules. Il est important de prendre des mesures pour protéger les cellules du stress induit par la lumière et de la décoloration des colorants fluorescents. Au cours de nos travaux, nous avons testé différentes méthodes et protocoles de transfection ainsi que différents vecteurs afin de sélectionner la meilleure combinaison de conditions adaptées aux études de fibroblastes primaires humains. Nous avons analysé les vidéos time-lapse résultantes et calculé la dynamique des microtubules à l’aide d’ImageJ. La dynamique des extrémités plus des microtubules dans les différentes parties cellulaires n’est pas similaire, nous avons donc divisé l’analyse en sous-groupes - la région centrosome, la lamelle et la queue des fibroblastes. Notamment, ce protocole peut être utilisé pour l’analyse in vitro de la dynamique du cytosquelette dans les échantillons de patients, permettant la prochaine étape vers la compréhension de la dynamique des différents développements de la maladie.

Les films GFP-EB3 produits à l’aide du protocole(Figure 1)illustrent les propriétés dynamiques des microtubules. Les microtubules sont impliqués dans différents processus cellulaires, et leurs propriétés dynamiques ont un impact sur diverses caractéristiques de vie de la culture cellulaire humaine primaire à partir du matériel de biopsie des patients (Figure 2).
Les paramètres suivants déterminent l’instabilité dynami...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Ce protocole est dédié à la visualisation des microtubules par transfection de la protéine EB3 afin d’étudier leurs propriétés dynamiques en culture cellulaire primaire. Le protocole a été mis en œuvre sur des fibroblastes cutanés primaires humains obtenus chez des patients atteints de la maladie de Huntington.

Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

La maladie de Huntington, MH, est une pathologie neurodégénérative incurable causée par une mutation d’un gène codant pour la protéine huntingtine. La huntingtine est principalement associée aux vésicules et aux microtubules, et probablement impliquée dans les processus de transport dépendants des microtubules. Pour étudier l’influence de la huntingtine mutante sur le dynamisme des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vivo de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en pliant et en stabilisant les extrémités positives en croissance.Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, nous avons appliqué une transfection de plasmides. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes pour obtenir à partir de la biopsie cutanée du patient EB3 pour cette étude. Administrer la biopsie au laboratoire en quelques heures en milieu DMEM, complétée par 15 microgrammes par millilitre de pénicilline et 50 unités par millilitre de streptomycine.Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de six centimètres, avec une petite quantité de milieu. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à un millimètre. Placez un, deux, fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 centimètres et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie.Ajouter lentement 1,5 millilitre d’un milieu de croissance. Cultiver des faisceaux de fibres dans le milieu de croissance dans un incubateur à CO2, dans 5% de CO2 soit sept centigrades, 80% d’humidité. Après quatre, sept jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.Culture cellulaire. Pour la visualisation de la transfection, des plats confocaux en verre, des plats confocaux doivent être utilisés. Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée.Incuber pendant 15 minutes. Préparez le support de culture. Bien mélanger, conserver haut à plus 4 centigrades.Réchauffer le milieu à plus 37 centigrades, avant de l’ajouter aux cellules. Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les cellules avec un DPBS stérile.Ajouter un millilitre de solution de trypsine préchauffée à 0,25% aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec un millilitre du milieu de culture.Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 200 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant, remettez en suspension la palette cellulaire dans un millilitre du milieu de culture.Comptez le numéro de cellule. Calculez le nombre requis de cellules. Désensemencez-les avec une densité de huit à 15, multipliée par 10 à la puissance de trois, passée d’un centimètre.Ceci est divisé en millilitres du milieu de culture. Retirer la solution de gélatine du plat de culture préparé pour l’inoculation et ajouter immédiatement deux millilitres de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à plus 37 centigrades dans un incubateur à CO2.Rafraîchissez le médium tous les deux, quatre jours. Pour les expériences, utilisez les cellules de quatre, 11 passages. Au moment de la transfection, la confluence ne doit pas dépasser 70, 80% Remplacer le milieu de culture par un milieu frais 24 heures avant la transfection.Préparez un complexe ADN-lipide, en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. L’agent de transfection liposomale et la densité de l’ensemencement cellulaire d’un, multiplié par 10 à la puissance de quatre cellules, passée d’un centimètre ont été utilisées. Ajouter trois microlitres de réactif commercial à 125 microlitres d’Opti-MEM, ne contenant aucun antibiotique.Sans toucher les parois du tube, remettez doucement en suspension. Diluer l’ADN plasmidique, GFP-EB3, en ajoutant un microgramme de l’ADN plasmidique à 125 microlitres d’OptiMEM. Remettez en suspension doucement.Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué, rapport un pour un. Incuber pendant 30 minutes. Ajoutez le complexe lipidique DE l’ADN à la boîte de Petri de six centimètres avec des cellules.Mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 secondes. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 heures, puis changer le milieu en un fluide frais. Analysez l’efficacité après inspection en 24 et 48 heures.Préparation à l’imagerie. Avant l’imagerie en direct des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence. Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la phase cellulaire moyenne pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement externe pour réduire la pénétration de l’O2 et l’évaporation du milieu.Utilisez une lampe macro et toutes les images dans un objectif 60 fois, 100 fois avec une ouverture numérique élevée pour prendre l’image. Car dans les observations viva, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris frapper la table optique, et la lentille pour passer 37 Centigrades, une chambre fermée était l’alimentation en CO2, et le soutien du niveau d’humidité. Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie.Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images. Définition des paramètres d’imagerie. Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lame induit des dommages aux cellules, réagit avec les espaces d’oxygène.Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, nous avons sélectionné une exposition de 300 millisecondes. Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt. Pour l’imagerie time-lapse à long terme, le système de stabilisation automatique de la mise au point, un système de mise au point parfait est nécessaire, car il peut y avoir un décalage le long de l’axe défini et l’objet d’intérêt sera donc flou.Choisissez les conditions d’imagerie optimales, en fonction de la photosensibilité de la cellule et de la vitesse de décoloration du chrome évasé. Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, le temps est raisonnablement court et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé une fréquence d’une image par seconde, pendant trois, cinq minutes.Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée, car sous l’influence de la lumière, il y a un saignement photo-saignable. Comme nous avons utilisé une fréquence d’imagerie relativement élevée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe était en retard pendant toute la période d’imagerie, qui s’estompe de plus en plus. Choisissez les vidéos optimales pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules, du rapport signal/bruit optimal et de l’absence de dérive de la cellule analysée.Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des microtubules plus-ends, en les plaçant dans le programme Fidji. L’étape la plus critique du protocole est la transfection, assurant une expression protéique suffisante. Un bon rapport signal/bruit, aucun photoblanchiment des microtubules et l’absence de dérive cellulaire sont essentiels pour l’imagerie.La visualisation in vivo de la dynamique des microtubules fournit des informations vitales sur les propriétés de la huntingtine mutante. Notre protocole peut être appliqué à des études d’autres maladies, dont la pathologie implique des propriétés dynamiques du cytosquelette.

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