Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Zuschuss Nr. 075-15-2019-1669 (Transfektion von Fibroblasten), von der Russischen Wissenschaftsstiftung, Zuschuss Nr. 19-15-00425 (alle anderen Arbeiten zur Kultivierung von Fibroblasten in vitro)finanziert. Es wurde teilweise vom Lomonosov Moscow State University Development Program PNR5.13 (Bildgebung und Analyse) unterstützt. Die Autoren danken für die Unterstützung des Nikon Center of Excellence am A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Wir möchten uns besonders bei Ekaterina Taran für ihre Hilfe bei der Sprachausgabe bedanken. Die Autoren danken auch Pavel Belikov für seine Hilfe bei der Videobearbeitung. Figuren in der Handschrift wurden mit BioRender.com geschaffen.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Bundesforschungs- und Klinischen Zentrums für Physikalisch-Chemische Medizin des Medizinischen Bundesamtes vom 08. September 2015.
HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Protokoll.
1. Gewinnung einer Primärkultur menschlicher Hautfibroblasten (Abbildung 2)
<ol><li>Bringen Sie die Biopsie innerhalb weniger Stunden ...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. 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C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Qualitativ bessere Ergebnisse für die Dynamikanalyse von Mikrotubuli können aus hochwertigen mikroskopischen Bildern gewonnen werden. Es ist wichtig, alle notwendigen Bedingungen für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen zu beachten und die Bildgebungsparameter korrekt einzustellen. Die Verwendung spezieller Zellkulturschalen mit Glasboden (konfokale Schalen) ist wichtig, da Glas einen anderen Lichtbrechungsindex aufweist als Kunststoff. Die Dicke des Glases und seine Gleichmäßigkeit über seine gesamte Fläche ...

Die Huntington-Krankheit (HD) ist eine unheilbare neurodegenerative Pathologie, die durch eine Mutation im Gen verursacht wird, das für dasHuntingtin-Protein (HTT) kodiert. HTT ist in erster Linie mit Vesikeln und Mikrotubuli assoziiert und wahrscheinlich an mikrotubuliabhängigen Transportprozessen beteiligt1,2. Um den Einfluss von mutiertem HTT auf die Dynamik der Mikrotubuli zu untersuchen, verwendeten wir in vitro die Visualisierung des EB3-Proteins, das die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli durch Bindung und Stabilisierung der wachsenden Plus-Enden reguliert. Um fluoreszierend markiertes EB3 in menschliche Hautfibroblasten zu laden, wurde eine Plasmidtransfektion angewendet. Wir verwendeten die primäre Fibroblastenkultur, die aus der Hautbiopsie der Huntington-Patienten für diese Studie gewonnen wurde.
Die Mutation im HTT-Protein-Gen führt zu einer Verlängerung des Polyglutamintraktes3. HTT spielt eine Rolle bei zellulären Prozessen wie Endozytose4,Zelltransport1,2,Proteinabbau5usw. Ein wesentlicher Teil dieser Prozesse betrifft verschiedene Elemente des Zellzytoskeletts, einschließlich der Mikrotubuli.
Menschliche Primärzellen sind das beste Modell, um Ereignisse, die in Patientenzellen auftreten, so genau wie möglich zu reproduzieren. Um solche Modelle zu erstellen, muss man Zellen aus menschlichem Biopsiematerial (z.B. aus chirurgischen Proben) isolieren. Die resultierende primäre Zelllinie eignet sich zur Untersuchung der Pathogenese mit verschiedenen genetischen, biochemischen, molekularen und zellbiologischen Methoden. Auch menschliche Primärzellkulturen dienen als Vorläufer für die Schaffung verschiedener transdifferenzierter und transgener Kulturen6.
Im Gegensatz zu immortalisierten Zellkulturen ist der wesentliche Nachteil von Primärzellen jedoch ihre begrenzte Passagefähigkeit. Daher empfehlen wir die Verwendung von Zellen im frühen Passagenstadium (bis zu 15). Ältere Kulturen degenerieren sehr schnell und verlieren ihre einzigartigen Eigenschaften. Daher sollten die neu gewonnenen Primärzellen für die Langzeitlagerung eingefroren gehalten werden.
Primäre Zellkulturen sind anfällig für Kultivierungsbedingungen. Daher erfordern sie oft einzigartige Ansätze und die Optimierung der Wachstumsbedingungen. Insbesondere die primären Fibroblasten der menschlichen Haut, die in unseren Experimenten verwendet werden, stellen hohe Anforderungen an das Substrat. Daher haben wir je nach Versuchstyp verschiedene zusätzliche Beschichtungen (z.B. Gelatine oder Fibronektin) verwendet.
Das Zellzytoskelett bestimmt die Zellform, Beweglichkeit und Fortbewegung. Die Dynamik des Zytoskeletts ist entscheidend für viele intrazelluläre Prozesse sowohl in der Interphase als auch in der Mitose. Insbesondere das aus Tubulin polymerisierte Zytoskelett sind hochdynamische und polare Strukturen, die einen motorproteinvermittelten gerichteten intrazellulären Transport ermöglichen. Die Enden der Mikrotubuli befinden sich in ständiger Neuanordnung, ihre Montagephasen wechseln sich mit den Demontagephasen ab, und dieses Verhalten wird als "dynamische Instabilität"bezeichnet 7,8,9. Verschiedene assoziierte Proteine verschieben das Gleichgewicht der Polymerisationsreaktion, was entweder zur Polymerbildung oder zur Proteinmonomerbildung führt. Die Zugabe von Tubulin-Untereinheiten erfolgt hauptsächlich am Plus-Ende der Mikrotubuli10. Die Familie der endbindenden (EB) Proteine besteht aus drei Mitgliedern: EB1, EB2 und EB3. Sie dienen als Plus-End-Tracking-Proteine (+TIPs) und regulieren die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli, indem sie ihre wachsenden Plus-Enden binden und stabilisieren11.
Viele Studien verwenden fluoreszierende Molekül-markierte Tubulin-Mikroinjektion oder Transfektion mit Zeitraffer-Bildgebung und Videoanalyse, um Mikrotubuli in vitrozu visualisieren. Diese Methoden können invasiv und schädlich für Zellen sein, insbesondere für primäre menschliche Zellen. Der schwierigste Schritt besteht darin, Bedingungen für die Zelltransfektion zu finden. Wir haben versucht, das höchstmögliche Maß an Transfektion zu erreichen, ohne die Lebensfähigkeit und die native Zellmorphologie zu beeinträchtigen. Diese Studie wendet die klassische Methode an, um die Unterschiede in der Mikrotubulidynamik in Hautfibroblasten von gesunden Spendern und Patienten mit der Huntington-Krankheit zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Die Transfektion mit einem fluoreszenzmarkierten Markerprotein von Interesse in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ist eine klassische Methode zur Untersuchung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts. Dieses Protokoll bietet eine Technik für die primäre Fibroblastentransfektion des Menschen, die aufgrund der Besonderheiten der primären Zellkultivierungsbedingungen schwierig sein kann. Darüber hinaus erfordert die Aufrechterhaltung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts ein geringes Maß an Transfektion, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, ohne eine Mikrotubuli-Stabilisierung zu verursachen. Es ist wichtig, Maßnahmen zu ergreifen, um die Zellen vor lichtinduziertem Stress und dem Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen zu schützen. Im Laufe unserer Arbeit testeten wir verschiedene Transfektionsmethoden und -protokolle sowie verschiedene Vektoren, um die beste Kombination von Bedingungen auszuwählen, die für humane primäre Fibroblastenstudien geeignet sind. Wir analysierten die resultierenden Zeitraffervideos und berechneten die Mikrotubuli-Dynamik mit ImageJ. Die Dynamik der Pluspunkte der Mikrotubuli in den verschiedenen Zellteilen ist nicht ähnlich, daher haben wir die Analyse in Untergruppen unterteilt - die Zentrosomenregion, die Lamelle und den Schwanz der Fibroblasten. Insbesondere kann dieses Protokoll für die In-vitro-Analyse der Zytoskelettdynamik in Patientenproben verwendet werden, was den nächsten Schritt zum Verständnis der Dynamik der verschiedenen Krankheitsentwicklungen ermöglicht.

Die resultierenden GFP-EB3-Filme, die mit dem Protokoll hergestellt wurden (Abbildung 1), veranschaulichen die dynamischen Eigenschaften der Mikrotubuli. Mikrotubuli sind an verschiedenen Zellprozessen beteiligt, und ihre dynamischen Eigenschaften beeinflussen verschiedene Lebenseigenschaften der primären menschlichen Zellkultur aus dem Biopsiematerial des Patienten (Abbildung 2).
Die folgenden Parameter bestimmen die dynamische Inst...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Dieses Protokoll ist der Mikrotubuli-Plus-End-Visualisierung durch EB3-Proteintransfektion gewidmet, um ihre dynamischen Eigenschaften in der primären Zellkultur zu untersuchen. Das Protokoll wurde an menschlichen primären Hautfibroblasten implementiert, die von Huntington-Patienten gewonnen wurden.

Mikrotubuli Plus-End Dynamics Visualisierung im Huntington-Modell basierend auf humanen primären Hautfibroblasten

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Die Huntington-Krankheit, die Huntington-Krankheit, ist eine unheilbare, neurodegenerative Pathologie, die durch eine Mutation im Gen verursacht wird, das für das Huntingtin-Protein kodiert. Das Huntingtin ist in erster Linie mit Vesikeln und Mikrotubuli assoziiert und wahrscheinlich an mikrotubuliabhängigen Transportprozessen beteiligt. Um den Einfluss von mutiertem Huntingtin auf die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen, verwendeten wir die In-vivo-Visualisierung des EB3-Proteins, das die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli reguliert, indem es die wachsenden Plus-Enden biegt und stabilisiert.Um fluoreszierend markiertes EB3 in menschliche Hautfibroblasten zu laden, haben wir Plasmidtransfektion angewendet. Wir verwendeten die primäre Fibroblastenkultur, um aus der Hautbiopsie des EB3-Patienten für diese Studie zu gewinnen. Liefern Sie die Biopsie innerhalb weniger Stunden in DMEM-Medium an das Labor, ergänzt mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin und 50 Einheiten pro Milliliter Streptomycin.Legen Sie Biopsiegewebe in eine sechs Zentimeter Petrischale, zusammen mit einer kleinen Menge Medium. Schneiden Sie die Biopsieprobe mit einem sterilen Skalpell in etwa 0,5 bis einen Millimeter große Stücke. Legen Sie ein, zwei erhaltene Fragmente in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale und legen Sie einen sterilen Deckschleim über die Biopsiestücke.Fügen Sie langsam 1,5 Milliliter eines Wachstumsmediums hinzu. Kulturfaserblasten im Wachstumsmedium in einem CO2-Inkubator, in 5% CO2, das sind sieben Grad Celsius, 80% Luftfeuchtigkeit. Nach vier, sieben Tagen beginnen zuerst Keratinozyten, dann Fibroblasten vom Gewebe zum Boden der Schale zu wandern.Zellkultivierung. Für die Visualisierung der Transfektion sollten konfokale Glasplattenschalen, konfokale Gerichte verwendet werden. Den Schalenboden mit autoklavierter 0,1%iger Gelatinelösung bedecken, die in Destillatwasser zubereitet wird.15 Minuten inkubieren. Bereiten Sie das Kulturmedium vor. Gründlich mischen, hoch bei plus 4 Grad Celsius lagern.Erwärmen Sie das Medium auf plus 37 Grad Celsius, bevor Sie es zu den Zellen hinzufügen. Beurteilen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einem sterilen DPBS.Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmte 0,25% Trypsinlösung zu den Zellen hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, ob sie sich vollständig vom Substrat lösen. Deaktivieren Sie Trypsin mit einem Milliliter des Kulturmediums.Die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellpalette in einem Milliliter des Kulturmediums.Zählen Sie die Zellennummer. Berechnen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen. Entkernen Sie sie mit einer Dichte von acht bis 15, multipliziert mit 10 hoch drei, um einen Zentimeter passiert.Diese wird in Milliliter des Kulturmediums geschwenkt. Nehmen Sie die Gelatinelösung aus der für die Impfung vorbereiteten Kulturschale und fügen Sie sofort zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu. Kultivieren Sie Fibroblasten mit plus 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator.Aktualisieren Sie das Medium alle zwei, vier Tage. Verwenden Sie für Experimente die Zellen von vier, 11 Passagen. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollte der Zusammenfluss nicht mehr als 70, 80% betragen Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 Stunden vor der Transfektion durch ein frisches.Bereiten Sie einen DNA-Lipid-Komplex vor, der auf der Fläche und Dichte der Zellaussaat basiert. Liposomales Transfektionsmittel und die Dichte der Zellaussaat von eins, multipliziert mit 10 hoch vier Zellen, wurde um einen Zentimeter überschritten. Fügen Sie drei Mikroliter kommerzielles Reagenz zu 125 Mikrolitern Opti-MEM hinzu, die kein Antibiotikum enthalten.Ohne die Rohrwände zu berühren, vorsichtig resuspendieren. Verdünnte Plasmid-DNA, GFP-EB3, wobei ein Mikrogramm der Plasmid-DNA zu 125 Mikrolitern OptiMEM hinzugefügt wird. Vorsichtig resuspendieren.Fügen Sie verdünnte Plasmid-DNA zu jedem Röhrchen verdünnter Transfektionsreagenz hinzu, ein zu eins Verhältnis. 30 Minuten inkubieren. Fügen Sie den DNA-Lipidkomplex der sechs Zentimeter langen Petrischale mit Zellen hinzu.Mit einem kreuzförmigen Schwung für 30 Sekunden mischen. Inkubieren Sie Zellen mit einem Transfektionsmittel für 24 Stunden und wechseln Sie dann das Medium in ein frisches. Analysieren Sie die Effizienz nach der Inspektion in 24 und 48 Stunden.Vorbereiten der Bildgebung. Vor der Live-Bildgebung von Zellen ändern Sie das Kulturmedium in ein Medium ohne PH-Indikatorfarbstoff, um die Autofluoreszenz zu reduzieren. Tragen Sie Mineralöl vorsichtig auf die mittlere Zellphase auf, um das Medium vollständig abzudecken, und isolieren Sie es von der äußeren Umgebung, um das Eindringen von O2 und die Verdampfung des Mediums zu reduzieren.Verwenden Sie eine Makrolampe und das gesamte Bild in einem 60-fachen, 100-fachen Objektiv mit hoher Ziffernöffnung, um ein Bild aufzunehmen. Denn in der viva-Beobachtung muss das Mikroskop mit einem Inkubator ausgestattet sein, um die notwendigen Bedingungen für die Zellen aufrechtzuerhalten, einschließlich des Schlagens auf den Sehtisch und der Linse, um 37 Grad Celsius zu passieren, eine geschlossene Kammer war CO2-Versorgung und Feuchtigkeitsunterstützung. Legen Sie die konfokale Schale mit den Zellen vor der Bildgebung in den Halter des Mikroskops.Stellen Sie sicher, dass die Schüssel und die Kamera sicher an der Halterung befestigt sind, um ein Driften während der Aufnahme von Bildern zu vermeiden. Festlegen der Imaging-Parameter. Wählen Sie die niedrigen Expositionswerte, da der Objektträger zellschädigend induziert, mit Sauerstoffräumen reagiert.Um die Dynamik von Mikrotubuli in menschlichen Hautfibroblasten zu untersuchen, wählten wir eine 300-Millisekunden-Exposition. Konzentrieren Sie sich auf das Objekt von Interesse. Für Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung, das automatische Fokusstabilisierungssystem, ist ein perfektes Fokussystem erforderlich, da es zu einer Verschiebung entlang der eingestellten Achse kommen kann und das Objekt von Interesse somit unscharf ist.Wählen Sie die optimalen Bildgebungsbedingungen, abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Zelle und der Geschwindigkeit des Verblassens des Flare-Chroms. Da mikrotubuli hochdynamische Strukturen sind, können wiederum relativ kurze Zeit gewählt werden, und die Bildrate muss ausreichend hoch sein. Um die Mikrotubuli-Dynamik in Hautfibroblasten zu untersuchen, verwendeten wir eine Frequenz von einem Bild pro Sekunde für drei, fünf Minuten.Wenn Sie das nächste Objekt auswählen, um ein Bild zu erhalten, entfernen Sie sich von dem bereits abgebildeten Bereich, da unter dem Einfluss von Licht eine verstrichene Fotoblutung auftritt. Da wir eine relativ hohe Abbildungsfrequenz verwendet haben, schloss sich der Verschluss zwischen den Bildern nicht, und die Lampe kam während der gesamten Bildgebungsdauer zu spät, was zunehmend verblasst. Wählen Sie die optimalen Videos für die visuelle Untersuchung der Mikrotubulidynamik unter Berücksichtigung der Qualität der Transfektion, der Qualität der Bilder der Mikrotubuli, des optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses und der Abwesenheit von Drift der analysierten Zelle.Verwenden Sie die ausgewählten Videos, um die Dynamik der Mikrotubuli plus Enden zu untersuchen, indem Sie sie im Fidschi-Programm traversieren. Der kritischste Schritt im Protokoll ist die Transfektion, die eine ausreichende Proteinexpression gewährleistet. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, kein Photobleichen von Mikrotubuli und das Fehlen von Zelldrift sind entscheidend für die Bildgebung.Die In-vivo-Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik liefert wichtige Informationen über die Eigenschaften von mutiertem Huntingtin. Unser Protokoll kann auf Studien anderer Krankheiten angewendet werden, deren Pathologie dynamische Eigenschaften des Zytoskeletts impliziert.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Forschung

Biotechnik

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...