Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מס '075-15-2019-1669 (טרנספקטים של פיברובלסטים), על ידי הקרן הרוסית למדע, מענק מס '19-15-00425 (כל שאר העבודות על טיפוח פיברובלסטים במבחנה). זה נתמך חלקית על ידי Lomonosov מוסקבה המדינה האוניברסיטה פיתוח תוכנית PNR5.13 (הדמיה וניתוח). המחברים מכירים בתמיכת מרכז ניקון למצוינות במכון א.נ. בלוצרסקי לביולוגיה פיזיקו-כימית. אנחנו רוצים להודות במיוחד ליקטרינה טארן על עזרתה במשחק קול. המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המרכז הפדרלי למחקר ולרפואה קלינית של רפואה פיזית-כימית של הסוכנות הביולוגית הרפואית הפדרלית מיום 08 בספטמבר 2015.
הערה: איור 1 מספק מבט כולל על הפרוטוקול.
1. השגת תרבות עיקרית של פיברובלסטים בעור האדם (<strong cl...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

ניתן להשיג תוצאות באיכות טובה יותר לניתוח הדינמיקה של microtubules מתמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה. חשוב לבחון את כל התנאים הדרושים להדמיה של תאים חיים בזמן ולהתאים נכונה את פרמטרי ההדמיה. שימוש במנות מיוחדות לתרבות תאים עם תחתית זכוכית (מנות קונפוקליות) חשוב, שכן זכוכית יש אינדקס שבירה שונה ...

מחלת הנטינגטון (HD) היא פתולוגיה נוירודגנרטיבית חשוכת מרפא הנגרמת על ידי חלבון קידוד גן מוטציה (HTT). HTT קשורה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות והוא מעורב כנראה בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול1,2. כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה HTT על דינמיקת microtubule, השתמשנו בהדמיה חוץ גופית של חלבון EB3, המווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כריכה וייצוב הפלוס-קצוות הגדלים. כדי לטעון פלואורסצנטית שכותרתו EB3 לתוך פיברובלסטים בעור אנושי, transfection plasmid הוחל. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית שהתקבלה מהביופסיה של העור של חולי HD למחקר זה.
המוטציה בגן חלבון HTT מובילה להארכה של דרכי פוליגלוטמין3. HTT יש תפקיד בתהליכים תאיים כגון אנדוציטוזיס4, הובלת תאים1,2, השפלת חלבון5,וכו '. חלק ניכר מהתהליכים הללו כרוך באלמנטים שונים של ציטוסקלטון התא, כולל המיקרוטובולות.
תאים ראשוניים אנושיים הם המודל הטוב ביותר לשחזור אירועים המתרחשים בתאי המטופל קרוב ככל האפשר. כדי ליצור מודלים כאלה, יש לבודד תאים מחומר ביופסיה אנושי (למשל, מדגימות כירורגיות). קו התאים העיקרי המתקבל מתאים לחקר פתוגנזה בשיטות ביולוגיות גנטיות, ביוכימיות, מולקולריות ותאיות שונות. כמו כן, תרביות תאים ראשוניות אנושיות משמשות מבשר ליצירת תרבויות שונות transdifferentiated ומהונדס6.
עם זאת, בניגוד תרביות תאים מונצחות, החיסרון המשמעותי של תאים ראשוניים הוא יכולת המעבר המוגבלת שלהם. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאים בשלב המעברים המוקדמים (עד 15). תרבויות ישנות יותר מתנוונות מהר מאוד, מאבדות את תכונותיהן הייחודיות. לכן, התאים העיקריים שהושגו לאחרונה צריכים להישמר קפואים לאחסון לטווח ארוך.
תרביות התאים העיקריות רגישות לתנאי הטיפוח. לכן, לעתים קרובות הם דורשים גישות ייחודיות ואופטימיזציה של תנאי הגידול. בפרט, הפיברובלסטים העיקריים של העור האנושי המשמשים בניסויים שלנו תובעניים על המצע. לפיכך, השתמשנו בציפויים נוספים שונים (למשל, ג'לטין או פיברונקטין) בהתאם לסוג הניסוי.
ציטוסקלטון התא קובע את צורת התא, הניידות והקטר. הדינמיקה של הציטוסקלטון חיונית לתהליכים תאיים רבים הן באינטרפאזה והן במיטוזה. בפרט, הציטוסקלטון פולימר מ טובולין, הם מבנים דינמיים מאוד קוטביים, המאפשרים תחבורה תאית מכוונת בתיווך חלבון מוטורי. קצות המיקרוטובולות נמצאים בסידור מחדש מתמיד, שלבי ההרכבה שלהם מתחלפים עם שלבי הפירוק, והתנהגות זו נקראת "חוסר יציבות דינמית"7,8,9. חלבונים שונים הקשורים לשנות את שיווי המשקל של תגובת פילמור, המוביל או היווצרות פולימר או היווצרות מונומר חלבון. התוספת של subunits טובולין מתרחשת בעיקר בקצה פלוס של microtubules10. משפחת החלבונים המחייבים את הקצה (EB) מורכבת משלושה חברים: EB1, EB2 ו-EB3. הם משמשים חלבונים במעקב אחר קצה פלוס (+TIPs) ומווסתים את המאפיינים הדינמיים של מיקרוטובולות על ידי כריכה וייצוב הגדילה שלהם פלוס-קצוות11.
מחקרים רבים משתמשים במיקרו-אינטרינג'קציה או טרנס-מולקולה של טובולין עם הדמיה בזמן וניתוח וידאו כדי לדמיין מיקרוטובולות במבחנה. שיטות אלה עלולות להיות פולשניות ומזיקות לתאים, במיוחד לתאים אנושיים ראשוניים. הצעד המאתגר ביותר הוא למצוא תנאים להדבקה בתאים. ניסינו להגיע לרמה הגבוהה ביותר האפשרית של טרנס-זיהום מבלי להשפיע על הכדאיות ועל מורפולוגיה של תאים מקומיים. מחקר זה מיישם את השיטה הקלאסית כדי לחקור את ההבדלים בדינמיקה microtubule בפיברובלסטים בעור של תורמים בריאים וחולים עם מחלת הנטינגטון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

טרנספקטיון עם חלבון סמן שכותרתו פלואורסצנטית של עניין בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן היא שיטה קלאסית של לימוד המאפיינים הדינמיים של ציטוסקלטון. פרוטוקול זה מציע טכניקה עבור טרנספקט פיברובלסט ראשוני אנושי, אשר יכול להיות קשה בגלל הפרטים של תנאי טיפוח התא העיקריים. בנוסף, תחזוקת הנכס הדינמי של ציטוסקלטון דורשת רמה נמוכה של טרנספקטציה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מבלי לגרום לייצוב מיקרוטובול. חשוב לנקוט באמצעים כדי להגן על התאים מפני מתח המושרה באור ודחיכת צבע פלואורסצנטי. במהלך עבודתנו, בדקנו שיטות ופרוטוקולים שונים של טרנספקטיישן, כמו גם וקטורים שונים כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של תנאים המתאימים למחקרי פיברובלסט ראשוניים אנושיים. ניתחנו את הסרטונים שהתקבלו בזמן וחישוב דינמיקת המיקרו-קוטביות באמצעות ImageJ. הדינמיקה של המיקרוטובולים בחלקי התא השונים אינה דומה, ולכן חילקנו את הניתוח לתת-קבוצות - אזור המרכז, הלאמלה וזנב הפיברובלסטים. ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח במבחנה של דינמיקת cytoskeleton בדגימות המטופל, המאפשר את הצעד הבא לקראת הבנת הדינמיקה של התפתחות המחלה השונה.

סרטי GFP-EB3 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול (איור 1) ממחישים את המאפיינים הדינמיים של המיקרוטובולות. מיקרוטובולות מעורבות בתהליכים שונים של תאים, ומאפייניהם הדינמיים משפיעים על מאפייני חיים שונים של תרבית התאים האנושיים העיקרית מחומר הביופסיה של המטופלים (איור 2).</...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

מחלת הנטינגטון, HD, היא פתולוגיה חשוכת מרפא, ניווניות הנגרמת על ידי מוטציה בחלבון ציד קידוד גנים. הצייד מזוהה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות, וכנראה מעורב בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול. כדי לחקור את ההשפעה של ציד מוטציות על הדינמיות של microtubules, השתמשנו בהדמיה vivo של חלבון EB3, אשר מווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כיפוף וייצוב הקצוות ההולכים וגדלים.כדי לטעון EB3 עם תווית פלואורסצנטית לפיברובלסטים של העור האנושי, החלנו תעתיק פלסמיד. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית כדי להשיג מהביופסיה של העור של חולה EB3 למחקר זה. לספק את הביופסיה למעבדה בתוך כמה שעות בינוני DMEM, בתוספת 15 מיקרוגרם למיליליטר של פניצילין, ו 50 יחידות למיליליטר של סטרפטומיצין.מניחים רקמת ביופסיה בצלחת פטרי של שישה ס"מ, יחד עם כמות קטנה של בינוני. באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את דגימת הביופסיה לחתיכות על 0.5 עד אחד מילימטרים בגודל. מניחים אחד, שניים, משיגים שברים לצלחת פטרי באורך 3.5 ס"מ, ומניחים כיסוי סטרילי מעל חתיכות הביופסיה.לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחה. סיבים תרבותיים במדיום הצמיחה באינקובטור CO2, ב-5% CO2 שהוא שבעה סנטיגרד, 80% לחות. לאחר ארבעה, שבעה ימים, תחילה קרטינוציטים, ואז פיברובלסטים מתחילים לנדוד מהרקמה לתחתית המנה.טיפוח תאים. להדמיה טרנספקטי, יש להשתמש במנות צלחת קונפוקליות מזכוכית, יש להשתמש במנות קונפוקליות. מכסים את החלק התחתון של המנה בתמיסת ג'לטין אוטומטית של 0.1%, המוכנה במים מזוקקים.דגירה במשך 15 דקות. הכן את המדיום התרבותי. מערבבים היטב, מאחסנים גבוה פלוס 4 סנטיגרד.מחממים את המדיום לפלוס 37 מעלות צלזיוס, לפני שמוסיפים לתאים. להעריך את התרבות מתחת למיקרוסקופ. הסר את המדיום, ולשטוף את התאים עם DPBS סטרילי.הוסף מיליליטר אחד של פתרון טריפסין 0.25% מחומם מראש לתאים. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ אם הם מתנתקים לחלוטין מהמצע. בטל טריפסין עם מיליליטר אחד של מדיום התרבות.העבר את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 200 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant, resuspend לוח התא במיליליטר אחד של המדיום התרבותי.תספור את מספר התא. חשב את מספר התאים הנדרש. דה-זרע אותם עם צפיפות של שמונה עד 15, מוכפל על ידי 10 לכוח של שלושה, עבר על ידי סנטימטר.זה מחולק למיליליטרים של המדיום התרבותי. הסר את פתרון הג'לטין מצלחת התרבות מוכנה לחיסון, ומיד להוסיף שני מיליליטר של השעיית התא. לטפח פיברובלסטים בנוסף 37 סנטיגרד בחממה CO2.רענן את המדיום כל יומיים, ארבעה ימים. לניסויים, השתמש בתאים של ארבעה, 11 מעברים. עד ההדבקה, המפגש צריך להיות לא יותר מ 70, 80%להחליף את המדיום התרבותי עם אחד טרי 24 שעות לפני transfection.הכן קומפלקס DNA-שומנים, המבוסס על האזור והצפיפות של זריעת התא. סוכן טרנספקטיון ליפוזומלי, ואת הצפיפות של זריעת התא של אחד, מוכפל על ידי 10 לכוח של ארבעה תאים, עבר על ידי סנטימטר שימש. הוסף שלושה מיקרוליטרים של ריאגנט מסחרי ל-125 מיקרוליטרים של Opti-MEM, ללא אנטיביוטיקה.מבלי לגעת בקירות הצינור, יש לגעת בעדינות. לדלל DNA plasmid, GFP-EB3, הוספת מיקרוגרם אחד של DNA plasmid ל 125 microliters של OptiMEM. בעדינות resuspend.הוסף DNA פלסמי מדולל לכל שפופרת של ריאגנט טרנס-זיהום מדולל, יחס אחד לאחד. דגירה במשך 30 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA לצלחת פטרי שישה סנטימטרים עם תאים.מערבבים עם נדנדה צליבה במשך 30 שניות. דגירה תאים עם סוכן transfection במשך 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את המדיום לרענן אחד. לנתח את היעילות לאחר בדיקה ב 24 ו 48 שעות.מתכונן להדמיה. לפני הדמיה חיה של תאים, לשנות את המדיום התרבותי למדיום ללא צבע מחוון PH כדי להפחית את autofluorescence. יש למרוח בזהירות שמן מינרלי על שלב התא הבינוני כדי לכסות לחלוטין את המדיום, ולבודד אותו מהסביבה החיצונית כדי להפחית את חדירת ה- O2 ואת האידוי הבינוני.השתמש במנורת מאקרו ובכל התמונה בעדשה אובייקטיבית של פי 60, פי 100 עם צמצם ספרות גבוה כדי לצלם תמונה. עבור תצפיות ויוה, המיקרוסקופ חייב להיות מצויד באינקובטור כדי לשמור על התנאים הדרושים לתאים, כולל פגיעה בשולחן האופטי, ואת העדשה לעבור 37 Centigrade, תא סגור היה אספקת CO2, ותמיכה ברמת הלחות. מניחים את צלחת הקונפוקלי עם התאים במחזיק המיקרוסקופ לפני ההדמיה.ודא כי המנה והמצלמה מחוברים באופן מאובטח למחזיק כדי למנוע נסחף בעת צילום תמונות. הגדרת פרמטרי ההדמיה. בחר את ערכי החשיפה הנמוכים, מאחר שהשקופית גורם לפגיעה בתאים, מגיבה עם מרחבי חמצן.כדי לחקור את הדינמיקה של מיקרוטובולות בפיברובלסטים של העור האנושי, בחרנו חשיפה של 300 אלפיות השנייה. תתמקד במושא העניין. עבור הדמיה ארוכת שנים, זמן-לשגות, מערכת ייצוב המיקוד האוטומטית, מערכת מיקוד מושלמת היא הכרחית, שכן ייתכן שיש שינוי לאורך הציר להגדיר, ואת מושא העניין יהיה אפוא מחוץ לפוקוס.בחר את תנאי ההדמיה האופטימליים, בהתאם לחשיות של התא ולקצב דועך הכרום התלקחי. מאז microtubules הם מבנים דינמיים מאוד, הם זמן קצר למדי בתורו ניתן לבחור, ואת קצב הפריימים חייב להיות גבוה מספיק. כדי לחקור את הדינמיקה של המיקרוטובולים בפיברובלסטים של העור, השתמשנו בתדר של מסגרת אחת לשנייה, במשך שלוש, חמש דקות.בעת בחירת האובייקט הבא כדי לקבל תמונה, התרחק מהאזור שכבר התמונה, שכן תחת השפעת האור, יש דימום תמונה חולף. מכיוון שהשתמשנו בתדר הדמיה גבוה יחסית, התריס לא נסגר בין תמונות, והמנורה איחרה לכל תקופת ההדמיה, אשר דועכת גדלה. בחר את הסרטונים האופטימליים לחקר הדינמיקה של המיקרוטובול באופן חזותי, תוך התחשבות באיכות ההדבקה, באיכות התמונות של המיקרוטובולות, יחס אות לרעש אופטימלי והיעדר נסחף של תאים מנותחים.השתמש בסרטונים שנבחרו כדי ללמוד את הדינמיקה של המיקרוטובולות בתוספת הקצוות, על-ידי מסבך אותם בתוכנית פיג'י. הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא טרנספקטציה, המבטיחה ביטוי חלבון מספיק. יחס אות לרעש טוב, ללא צילומים של מיקרוטובולות והיעדר נסחף תאים הם קריטיים להדמיה.הדמיה של דינמיקת המיקרו-קוטביות מספקת מידע חיוני על תכונות הצייד המוטנטי. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על מחקרים של מחלות אחרות, אשר הפתולוגיה שלהן מסבכת תכונות דינמיות של ציטוסקלטון.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...