Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione n. 075-15-2019-1669 (trasfezione dei fibroblasti), dalla Russian Science Foundation, sovvenzione n. 19-15-00425 (tutti gli altri lavori sulla coltivazione di fibroblasti in vitro). È stato parzialmente supportato dal programma di sviluppo dell'Università statale di Mosca Lomonosov PNR5.13 (imaging e analisi). Gli autori riconoscono il supporto del Nikon Center of Excellence presso l'A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vogliamo offrire i nostri ringraziamenti speciali a Ekaterina Taran per la sua assistenza nella recitazione vocale. Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l'editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.

Questo protocollo segue le linee guida del Centro federale di ricerca e clinica di medicina fisico-chimica dell'Agenzia federale di biologia medica datate 8 settembre 2015.
NOTA: la Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo.
1. Ottenere una coltura primaria di fibroblasti cutanei umani (Figura 2)
<ol><li>Consegnare la biopsia a un laboratorio entro poche ore nel mez...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Risultati di migliore qualità per l'analisi dinamica dei microtubuli possono essere ottenuti da immagini microscopiche di alta qualità. È importante osservare tutte le condizioni necessarie per l'imaging time-lapse delle cellule viventi e regolare correttamente i parametri di imaging. L'uso di speciali piatti di coltura cellulare con un fondo di vetro (piatti confocali) è importante, poiché il vetro ha un diverso indice di rifrazione della luce rispetto alla plastica. Anche lo spessore del vetro e la sua uniformità...

La malattia di Huntington (HD) è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazionina del gene che codifica per la proteina cacciatina (HTT). L'HTT è principalmente associata a vescicole e microtubuli ed è probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli1,2. Per studiare l'influenza dell'HTT mutante sulla dinamica dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vitro della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i plus-end in crescita. Per caricare EB3 etichettato in modo fluorescente nei fibroblasti della pelle umana, è stata applicata la trasfezione del plasmide. Abbiamo utilizzato la coltura primaria di fibroblasti ottenuta dalla biopsia cutanea dei pazienti MH per questo studio.
La mutazione nel gene della proteina HTT porta all'allungamento del tratto poliglutammina3. HTT ha un ruolo in tali processi cellulari come l'endocitosi4, il trasporto cellulare1,2, la degradazione delle proteine5, ecc. Parte sostanziale di questi processi coinvolge vari elementi del citoscheletro cellulare, compresi i microtubuli.
Le cellule primarie umane sono il modello migliore per riprodurre il più fedelmente possibile gli eventi che si verificano nelle cellule dei pazienti. Per creare tali modelli, è necessario isolare le cellule dal materiale bioptico umano (ad esempio, da campioni chirurgici). La linea cellulare primaria risultante è adatta per studiare la patogenesi utilizzando vari metodi genetici, biochimici, molecolari e di biologia cellulare. Inoltre, le colture cellulari primarie umane fungono da precursore per la creazione di varie colture transdifferenziate e transgeniche6.
Tuttavia, a differenza delle colture cellulari immortalizzate, lo svantaggio significativo delle cellule primarie è la loro limitata capacità di passaggio. Pertanto, si consiglia di utilizzare le cellule nella fase dei primi passaggi (fino a 15). Le culture più vecchie degenerano molto rapidamente, perdendo le loro proprietà uniche. Pertanto, le cellule primarie appena ottenute dovrebbero essere mantenute congelate per la conservazione a lungo termine.
Le colture cellulari primarie sono suscettibili alle condizioni di coltivazione. Pertanto, spesso richiedono approcci unici e ottimizzazione delle condizioni di crescita. In particolare, i fibroblasti primari della pelle umana utilizzati nei nostri esperimenti sono esigenti sul substrato. Quindi, abbiamo usato vari rivestimenti aggiuntivi (ad esempio, gelatina o fibronectina) a seconda del tipo di esperimento.
Il citoscheletro cellulare determina la forma, la mobilità e la locomozione cellulare. La dinamica del citoscheletro è cruciale per molti processi intracellulari sia nell'interfase che nella mitosi. In particolare, il citoscheletro polimerizzato dalla tubulina, sono strutture altamente dinamiche e polari, consentendo il trasporto intracellulare diretto mediato da proteine motorie. Le estremità dei microtubuli sono in costante riarrangiamento, le loro fasi di assemblaggio si alternano alle fasi di smontaggio, e questo comportamento è chiamato "instabilità dinamica"7,8,9. Varie proteine associate spostano l'equilibrio della reazione di polimerizzazione, portando alla formazione del polimero o alla formazione del monomero proteico. L'aggiunta di subunità di tubulina avviene principalmente all'estremità superiore dei microtubuli10. La famiglia delle proteine end-binding (EB) è composta da tre membri: EB1, EB2 ed EB3. Servono come proteine plus-end-tracking (+TIP) e regolano le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i loro plus-end increscita 11.
Molti studi utilizzano la microiniezione o la trasfezione di tubulina marcata con molecole fluorescenti con imaging time-lapse e analisi video per visualizzare i microtubuli in vitro. Questi metodi potrebbero essere invasivi e dannosi per le cellule, in particolare le cellule umane primarie. Il passo più impegnativo è trovare le condizioni per la trasfezione cellulare. Abbiamo cercato di raggiungere il più alto livello possibile di trasfezione senza influire sulla vitalità e sulla morfologia delle cellule native. Questo studio applica il metodo classico per studiare le differenze nella dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei di donatori sani e pazienti con malattia di Huntington.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

La trasfezione con una proteina marcatore di interesse marcata fluorescente in combinazione con la videomicroscopia time-lapse è un metodo classico di studio delle proprietà dinamiche del citoscheletro. Questo protocollo offre una tecnica per la trasfezione dei fibroblasti primari umani, che può essere difficile a causa delle specifiche delle condizioni di coltivazione delle cellule primarie. Inoltre, il mantenimento della proprietà dinamica del citoscheletro richiede un basso livello di trasfezione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore senza causare la stabilizzazione dei microtubuli. È importante adottare misure per proteggere le cellule dallo stress indotto dalla luce e dallo sbiadimento del colorante fluorescente. Nel corso del nostro lavoro, abbiamo testato diversi metodi e protocolli di trasfezione, nonché diversi vettori per selezionare la migliore combinazione di condizioni adatte per gli studi sui fibroblasti primari umani. Abbiamo analizzato i video time-lapse risultanti e calcolato le dinamiche dei microtubuli utilizzando ImageJ. La dinamica delle estremità positive dei microtubuli nelle diverse parti cellulari non è simile, quindi abbiamo diviso l'analisi in sottogruppi: la regione centrosoma, la lamella e la coda dei fibroblasti. In particolare, questo protocollo può essere utilizzato per l'analisi in vitro della dinamica del citoscheletro in campioni di pazienti, consentendo il passo successivo verso la comprensione delle dinamiche del vario sviluppo della malattia.

I filmati GFP-EB3 risultanti prodotti utilizzando il protocollo (Figura 1) illustrano le proprietà dinamiche dei microtubuli. I microtubuli sono coinvolti in diversi processi cellulari e le loro proprietà dinamiche influenzano varie caratteristiche vitali della coltura cellulare umana primaria dal materiale bioptico dei pazienti (Figura 2).
I seguenti parametri determinano l'instabilità dinamica dei microtubuli: i tassi di crescita...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Questo protocollo è dedicato alla visualizzazione plus-end dei microtubuli mediante trasfezione della proteina EB3 per studiarne le proprietà dinamiche in coltura cellulare primaria. Il protocollo è stato implementato su fibroblasti cutanei primari umani ottenuti da pazienti affetti da Malattia di Huntington.

Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

La malattia di Huntington, MH, è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazione nel gene che codifica per la proteina huntingtina. L'huntingtina è principalmente associata a vescicole e microtubuli e probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli. Per studiare l'influenza dell'huntingtina mutante sul dinamismo dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vivo della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli piegando e stabilizzando i plus-end in crescita.Per caricare EB3 marcato fluorescentemente nei fibroblasti della pelle umana, abbiamo applicato la trasfezione del plasmide. Abbiamo usato la coltura primaria dei fibroblasti per ottenere dalla biopsia cutanea del paziente EB3 per questo studio. Consegnare la biopsia al laboratorio entro poche ore in mezzo DMEM, integrato con 15 microgrammi per millilitro di penicillina e 50 unità per millilitro di streptomicina.Posizionare il tessuto della biopsia in una capsula di Petri di sei centimetri, insieme a una piccola quantità di mezzo. Usando un bisturi sterile, tagliare il campione di biopsia in pezzi di circa 0,5-un millimetro. Metti uno, due, frammenti ottenuti in una capsula di Petri di 3,5 centimetri e posiziona una copertura sterile sui pezzi della biopsia.Aggiungere lentamente 1,5 millilitri di un mezzo di crescita. Fibra di coltura nel mezzo di crescita in un incubatore a CO2, in 5% CO2 che è sette centigradi, 80% di umidità. Dopo quattro, sette giorni, prima i cheratinociti, poi i fibroblasti iniziano a migrare dal tessuto al fondo del piatto.Coltivazione cellulare. Per la visualizzazione della trasfezione, devono essere utilizzati piatti confocali in vetro, piatti confocali. Coprire il fondo del piatto con una soluzione di gelatina autoclavata allo 0,1% preparata in acqua distillata.Incubare per 15 minuti. Preparare il mezzo culturale. Mescolare accuratamente, conservare alto a più 4 gradi centigradi.Riscaldare il mezzo a più 37 gradi centigradi, prima di aggiungere alle cellule. Valutare la coltura al microscopio. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con un DPBS sterile.Aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina 0,25% preriscaldata alle cellule. Controllare le cellule al microscopio se si staccano completamente dal substrato. Disattivare la tripsina con un millilitro del terreno di coltura.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 200 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante, risospesciare la tavolozza cellulare in un millilitro del terreno di coltura.Contare il numero di cella. Calcolare il numero richiesto di celle. De-seminarli con una densità da otto a 15, moltiplicata per 10 alla potenza di tre, passata di un centimetro.Questo è panned in millilitri del mezzo di coltura. Rimuovere la soluzione di gelatina dal piatto di coltura preparato per l'inoculazione e aggiungere immediatamente due millilitri della sospensione cellulare. Coltivare fibroblasti a più 37 gradi centigradi in un incubatore a CO2.Aggiorna il mezzo ogni due, quattro giorni. Per gli esperimenti, usa le celle di quattro, 11 passaggi. Al momento della trasfezione, la confluenza non deve essere superiore al 70%, 80% Sostituire il terreno di coltura con uno fresco 24 ore prima della trasfezione.Preparare un complesso DNA-lipidico, basato sull'area e sulla densità della semina cellulare. È stato utilizzato l'agente di trasfezione liposomiale e la densità della semina cellulare di uno, moltiplicata per 10 alla potenza di quattro cellule, passata di un centimetro. Aggiungere tre microlitri di reagente commerciale a 125 microlitri di Opti-MEM, senza antibiotico.Senza toccare le pareti del tubo, risospesci delicatamente. DNA plasmidico diluito, GFP-EB3, aggiungendo un microgrammo di DNA plasmidico a 125 microlitri di OptiMEM. Risospendare delicatamente.Aggiungere DNA plasmidico diluito a ciascun tubo di reagente di trasfezione diluito, rapporto uno a uno. Incubare per 30 minuti. Aggiungere il complesso lipidico del DNA alla capsula di Petri di sei centimetri con le cellule.Mescolare con un'altalena cruciforme per 30 secondi. Incubare le cellule con un agente di trasfezione per 24 ore, quindi cambiare il mezzo in uno fresco. Analizza l'efficienza dopo l'ispezione in 24 e 48 ore.Preparazione per l'imaging. Prima dell'imaging dal vivo delle cellule, cambiare il terreno di coltura in un mezzo senza colorante indicatore PH per ridurre l'autofluorescenza. Applicare con attenzione l'olio minerale alla fase della cellula media per coprire completamente il mezzo, isolandolo dall'ambiente esterno per ridurre la penetrazione di O2 e l'evaporazione media.Usa una lampada macro e tutte le immagini in un obiettivo 60 volte, 100 volte con apertura numerica elevata per scattare un'immagine. Per le osservazioni in viva, il microscopio deve essere dotato di un incubatore per mantenere le condizioni necessarie per le cellule, compreso il colpire la tavola ottica, e la lente per passare 37 gradi centigradi, una camera chiusa era l'alimentazione di CO2 e il supporto del livello di umidità. Posizionare il piatto confocale con le cellule nel supporto del microscopio prima dell'imaging.Assicurarsi che la parabola e la fotocamera siano saldamente attaccate al supporto per evitare la deriva durante lo scatto di immagini. Impostazione dei parametri di imaging. Scegli i bassi valori di esposizione, poiché il vetrino induce il danneggiamento delle cellule, reagisce con gli spazi di ossigeno.Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti della pelle umana, abbiamo selezionato un'esposizione di 300 millisecondi. Concentrati sull'oggetto di interesse. Per l'imaging time-lapse a lungo termine, è necessario il sistema di stabilizzazione automatica della messa a fuoco, il sistema di messa a fuoco perfetta, poiché potrebbe esserci uno spostamento lungo l'asse impostato e l'oggetto di interesse sarà quindi sfocato.Scegli le condizioni di imaging ottimali, a seconda della fotosensibilità della cella e della velocità di sbiadimento del cromo flare. Poiché i microtubuli sono strutture altamente dinamiche, è possibile selezionare un tempo ragionevolmente breve a sua volta e il frame rate deve essere sufficientemente alto. Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei, abbiamo usato una frequenza di un fotogramma al secondo, per tre, cinque minuti.Quando si seleziona l'oggetto successivo per ottenere l'immagine, allontanarsi dall'area già ripresa, poiché sotto l'influenza della luce, c'è un foto-sanguinamento elapsable. Poiché abbiamo utilizzato una frequenza di imaging relativamente elevata, l'otturatore non si è chiuso tra le immagini e la lampada era in ritardo per l'intero periodo di imaging, che sta svanendo aumentando. Scegli i video ottimali per studiare visivamente la dinamica dei microtubuli, tenendo conto della qualità della trasfezione, della qualità delle immagini dei microtubuli, del rapporto segnale-rumore ottimale e dell'assenza di deriva della cellula analizzata.Usa i video selezionati per studiare le dinamiche dei microtubuli plus-ends, travestendoli nel programma Fiji. Il passo più critico nel protocollo è la trasfezione, garantendo una sufficiente espressione proteica. Un buon rapporto segnale-rumore, nessuna fotosbiancamento dei microtubuli e l'assenza di deriva cellulare sono fondamentali per l'imaging.La visualizzazione in vivo della dinamica dei microtubuli fornisce informazioni vitali sulle proprietà dell'huntingtina mutante. Il nostro protocollo può essere applicato a studi di altre malattie, la cui patologia implica proprietà dinamiche del citoscheletro.

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