Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

この研究は、ロシア連邦の科学と高等教育省によって資金提供されました, 助成金0. 075-15-2019-1669 (線維芽細胞のトランスフェクション), ロシア科学財団によって, 助成金第19-15-00425 (vitroで線維芽細胞の栽培に関するすべての他の作品).これは、ロモノソフモスクワ州立大学開発プログラムPNR5.13(イメージングと分析)によって部分的にサポートされました。著者らは、A.N.ベロゼルスキー物理化学生物学研究所のニコン・センター・オブ・エクセレンスの支援を認めている。エカテリーナ・タランに、声優の支援をしてくれた方に、特別な感謝を申し上げたいと思っています。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。

このプロトコルは、2015年9月8日付の連邦医療生物機関の連邦研究および物理化学医療臨床センターのガイドラインに従っています。
注: 図 1 は、プロトコルの概要を示します。
1. ヒト皮膚線維芽細胞の一次培養を得る(図2)
<ol><li>50 μg/mLのペニシリンと50 U/mLのストレプトマイシン...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. 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C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

微小管のダイナミクス解析の品質の向上は、高品質の顕微鏡画像から得ることができます。生きている細胞のタイムラプスイメージングに必要なすべての条件を観察し、イメージングパラメータを正しく調整することが重要です。ガラスはプラスチックとは異なる屈折率を有するため、ガラス底部(共焦点皿)を備えた特殊な細胞培養皿を使用することは重要である。ガラスの厚さと領域全体?...

ハンチントン病(HD)は、タンパチンチンタンパク質(HTT)をコードする変異遺伝子によって引き起こされる不治の神経変性病理である。HTT は、主に小胞と微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセス1,2に関与している。微小管ダイナミクスに対する変異HTTの影響を研究するために、成長するプラスエンドを結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質のインビトロビジュアライゼーションを用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用した。この研究では、HD患者の皮膚生検から得られた原発性線維芽細胞培養を用いた。
HTTタンパク質遺伝子の変異は、ポリグルタミン管3の伸びにつながる。HTTは、エンドサイトーシス4、細胞輸送1、2、タンパク質分解5、等のような細胞プロセスにおいて役割を有する。これらのプロセスの大部分は、微小管を含む細胞細胞骨格の様々な要素を含む。
ヒトの初等細胞は、患者細胞で起こる事象を可能な限り密接に再現するのに最適なモデルです。このようなモデルを作成するには、ヒト生検材料(例えば、外科サンプルから)から細胞を分離する必要があります。得られた一次細胞株は、種々の遺伝的、生化学的、分子的、および細胞生物学の方法を用いて病原論を研究するのに適している。また、ヒト一次細胞培養は、様々なトランスフォー分化およびトランスジェニック培養を作成するための前駆体として機能する6。
しかし、不死化細胞培養とは対照的に、初代細胞の重大な欠点は、その限られた通過能力である。したがって、初期の通路段階(最大15)で細胞を使用することをお勧めします。古い文化は非常に迅速に退化し、そのユニークな特性を失います。したがって、新たに得られた一次細胞は、長期保存のために凍結しておくべきである。
一次細胞培養は、培養条件に影響を受けやすい。したがって、多くの場合、独自のアプローチと増大する条件の最適化が必要です。特に、我々の実験で使用されるヒト皮膚原発性線維芽細胞は、基質に要求されている。そこで、実験の種類に応じて、様々な追加コーティング(例えばゼラチンやフィブロネクチン)を用いた。
細胞骨格は、細胞の形状、移動度、および移動を決定します。細胞骨格の動態は、多くの細胞内プロセスにおいて、相間および有糸分裂の両方において極めて重要である。特に、チューブリンから重合した細胞骨格は、高い動的かつ極性構造であり、運動タンパク質媒介指向細胞内輸送を可能にする。微小管の末端は一定の再配置で、その組立相は分解相と交互に行われ、この動作は「動的不安定性」7、8、9と呼ばれる。様々な関連タンパク質は、重合反応の平衡をシフトし、ポリマー形成またはタンパク質モノマー形成のいずれかに導く。管状サブユニットの添加は、主に微小管10のプラスエンドで起こる。エンド結合(EB)タンパク質ファミリーは、EB1、EB2、EB3の3つのメンバーで構成されています。それらはプラスエンドトラッキングタンパク質(+TIP)として機能し、成長するプラスエンド11を結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節する。
多くの研究では、蛍光分子標識チューブリンマイクロインジェクションまたはトランスフェクションを使用して、タイムラプスイメージングとビデオ分析を行い、 インビトロで微小管を視覚化する。これらの方法は、細胞、特に初等ヒト細胞に侵襲的で有害である可能性があります。最も困難なステップは、細胞トランスフェクションの条件を見つけることです。生存率やネイティブ細胞形態に影響を与えることなく、可能な限り最高レベルのトランスフェクションに到達しようとしました。この研究は、健康なドナーとハンチントン病患者の皮膚線維芽細胞における微小管ダイナミクスの違いを研究するために古典的な方法を適用する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

蛍光標識マーカータンパク質とタイムラプスビデオ顕微鏡との組み合わせでのトランスフェクションは、細胞骨格の動的特性を研究する古典的な方法です。このプロトコルは、ヒトの原発性線維芽細胞トランスフェクションの技術を提供し、一次細胞培養条件の詳細のために困難であり得る。さらに、細胞骨格の動的特性の維持は微小管の安定化を引き起こすことなく良好な信号対雑音比を得るためにトランスフェクションの低レベルを必要とします。光によるストレスや蛍光色素の退色から細胞を保護する対策を講じるのが重要です。私たちの研究の過程で、我々は人間の一次線維芽細胞研究に適した条件の最良の組み合わせを選択するために、異なるトランスフェクション方法とプロトコルだけでなく、異なるベクターをテストしました。得られたタイムラプス動画を解析し、ImageJを用いて微小管ダイナミクスを計算した。異なる細胞部分における微小管のプラスエンドのダイナミクスは似ていないので、我々は分析をサブグループ(中心領域、ラメラ、線維芽細胞の尾)に分けました。特に、このプロトコルは、患者のサンプルにおける細胞骨格動態の インビトロ 分析に使用することができ、様々な疾患の発症のダイナミクスを理解するための次のステップを可能にする。

生成された GFP-EB3 ムービーは、プロトコルを使用して生成されます (図 1) マイクロチューブの動的特性を示しています。微小管は異なる細胞プロセスに関与しており、その動的特性は患者の生検材料からの原発ヒト細胞培養の様々な生命特性に影響を与える(図2)。
次のパラメータは、微小管の動的不安定性を決定します: 成長...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。

ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

ハンチントン病は、HDは、ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる不治の神経変性病理である。ハンチンチンは、主に小胞および微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセスに関与する。微小管のダイナミズムに対する変異ハンチンチンの影響を研究するために、成長するプラスエンドを曲げて安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質の生体内視覚化を用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用しました。この研究のために、EB3患者の皮膚生検から得るために原発性線維芽細胞培養を用いた。DMEM培地で数時間以内に検査室に生検を送り、ペニシリン1ミリリットル当たり15マイクログラム、ストレプトマイシン1ミリリットル当たり50単位で補う。生検組織を6センチのペトリ皿に少量の培地と一緒に入れます。無菌メスを使用して、生検サンプルを約0.5〜1ミリメートルの大きさに切ります。1つ、2つ、得られた断片を3.5センチメートルのペトリ皿に入れ、生検片の上に無菌カバースリップを置きます。ゆっくりと成長培地の1.5ミリリットルを追加します。培養繊維芽細胞は、CO2インキュベーター中の成長培地中で、5%CO2で7°C、湿度80%である。4日後、7日後、最初の角化細胞、次いで線維芽細胞が組織から皿の底に移行し始める。細胞培養。トランスフェクションビジュアライゼーション、ガラス共焦点プレート皿、共焦点皿を使用する必要があります。蒸留水で作られたオートクレーブ0.1%ゼラチン溶液で皿底を覆います。15分間インキュベートします。培地を準備します。完全に混ぜ、プラス4摂定で背の高い店。細胞に追加する前に、プラス37摂氏に培地を温めます。顕微鏡下で培養を評価する。培地を取り出し、滅菌DPBSで細胞を洗います。細胞に予温0.25%トリプシン溶液の1ミリリットルを追加します。基板から完全に切り離す場合は、顕微鏡下の細胞を確認してください。1ミリリットルの培養培地でトリプシンを非アクティブ化する。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐チューブに移します。チューブを200Gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、培養液の1ミリリットルで細胞パレットを再懸濁する。セル番号をカウントします。必要なセル数を計算します。8から15の密度でそれらを解凍し、10を3の力に掛け、センチメートルで通過します。これは、培養培地のミリリットルにパンされます。接種のために調製した培養皿からゼラチン溶液を取り出し、すぐに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。CO2インキュベーターでプラス37摂氏で線維芽細胞を栽培します。2日、4日ごとにメディアをリフレッシュします。実験のために、4、11の通路の細胞を使用する。トランスフェクションの時点で、合流度は70以下で、80%トランスフェクションの24時間前に培養液を新鮮なものに置き換える必要があります。細胞の播種の面積と密度に基づいて、DNA-脂質複合体を調製する。リポソームトランスフェクション剤は、1個の細胞播種の密度を、4細胞の電力に10を掛けて、1センチで通過した。オプティ-MEMの125マイクロリットルに3マイクロリットルの市販試薬を加え、抗生物質を含みない。チューブの壁に触れることなく、穏やかに再中断します。プラスミドDNAを希釈してGFP-EB3、プラスミドDNAの1マイクログラムを125マイクロリットルのOptiMEMに添加した。穏やかに再中断します。希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈プラスミドDNAを1対1の比率で加える。30分間インキュベートします。細胞と6センチメートルペトリ皿にDNA脂質複合体を追加します。十字架のスイングと30秒間混ぜます。細胞をトランスフェクション剤で24時間インキュベートし、培地を新鮮なものに変えます。24時間と48時間で検査後の効率を分析します。イメージングの準備をしています。細胞の生撮像前に、自己蛍光を低減するためにPH指標色素のない培地に培養培地を変更する。培地を完全にカバーするために培地細胞相に慎重に鉱油を塗布し、外部環境から単離してO2の浸透を低減し、媒体の蒸発を減らします。マクロランプと、画像を撮るために、高い数字の開口部を持つ60倍、100倍の対物レンズのすべての画像を使用してください。生体内観察のために、顕微鏡は、光学表を打つなど、細胞に必要な条件を維持するためにインキュベーターを装備する必要があり、レンズは37摂氏を通過し、密室はCO2供給、湿度レベルの支持を得る必要があります。画像化の前に、顕微鏡のホルダーに細胞と共焦点皿を置きます。画像を撮りながら漂わないように、皿とカメラがホルダーにしっかりと取り付けられていることを確認してください。イメージング パラメータを設定します。スライドは細胞損傷を誘発するので、低露出値を選択し、酸素空間と反応します。ヒト皮膚線維芽細胞における微小管の動態を研究するために、我々は300ミリ秒の曝露を選択した。関心のある対象に焦点を当てます。長時間、タイムラプスイメージング、自動フォーカス安定化システム、完璧なフォーカスシステムが必要であり、設定された軸に沿ってシフトが存在する可能性があるため、対象物は焦点が合っていない。セルの光感度とフレアクロムのフェージングの速度に応じて、最適なイメージング条件を選択します。微小管は非常に動的な構造であるため、合理的に短時間で選択することができ、フレームレートは十分に高くなければなりません。皮膚線維芽細胞の微小管ダイナミクスを調べるには、毎秒1フレームの頻度を3分、5分間使用しました。画像を取得する次のオブジェクトを選択する際には、既に画像化された領域から離れて、光の影響下で、露光可能なフォトブリーディングが存在する。比較的高い画像周波数を使用していたため、画像間のシャッターが閉じ、光が撮影の全期間遅れとなり、フェードが増えています。トランスフェクションの品質、微小管画像の品質、最適な信号対雑音比、分析された細胞のドリフトの欠如を考慮して、微小管ダイナミクスを視覚的に研究するための最適なビデオを選択します。選択したビデオを使用して、フィジープログラムでトラスして微小管プラスエンドダイナミクスを研究します。プロトコルの最も重要なステップはトランスフェクションであり、十分なタンパク質発現を保証します。良好な信号対雑音比、微小管の光化、および細胞の漂流の欠如は、イメージングにとって重要です。微小管ダイナミクスのインビボ視覚化は、変異ハンチンチンの特性に関する重要な情報を提供する。我々のプロトコルは、その病理が細胞骨格の動的特性を含む他の疾患の研究に適用することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

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三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

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ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

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Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...