Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland, gi No. 075-15-2019-1669 (transfeksjon av fibroblaster), av Den russiske vitenskapsstiftelsen, gi Nr. 19-15-00425 (alle andre arbeider om dyrking av fibroblaster in vitro). Det ble delvis støttet av Lomonosov Moscow State University Development program PNR5.13 (avbildning og analyse). Forfatterne anerkjenner støtten fra Nikon Center of Excellence ved A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi ønsker å tilby vår spesielle takk til Ekaterina Taran for hennes hjelp med stemmeskuespill. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjelp med videoredigering. Figurer i manuskriptet ble laget med BioRender.com.

Denne protokollen følger retningslinjene fra Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine fra Federal Medical Biological Agency datert 8.
MERK: Figur 1 gir en oversikt over protokollen.
1. Oppnå en primærkultur av humane hudfibroblaster (Figur 2)
<ol><li>Lever biopsien til et laboratorium innen få timer i Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) med...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Bedre kvalitetsresultater for mikrotubules dynamikkanalyse kan fås fra mikroskopiske bilder av høy kvalitet. Det er viktig å observere alle nødvendige forhold for tidsforløpavbildning av levende celler og for å justere bildeparametrene riktig. Bruk av spesielle cellekulturretter med glassbunn (konfokale retter) er viktig, siden glass har en annen brytningsindeks av lys enn plast. Tykkelsen på glasset og dets ensartethet over hele området er også ekstremt viktig, siden disse parametrene er avgjørende for normal ...

Huntingtons sykdom (HS) er en uhelbredelig nevrodegenerativ patologi forårsaket av et mutasjonsgenkodinghuntingtinprotein (HTT). HTT er primært forbundet med vesicles og mikrotubuler og er sannsynligvis involvert i mikrotubuleavhengige transportprosesser1,2. For å studere påvirkning av mutant HTT på mikrotubuldynamikken brukte vi in vitro-visualisering av EB3-proteinet, som regulerer mikrotubulens dynamiske egenskaper ved å binde og stabilisere de voksende pluss endene. For å laste fluorescerende merket EB3 inn i humane hudfibroblaster, ble plasmidtransfeksjon påført. Vi brukte den primære fibroblastkulturen hentet fra HS-pasientenes hudbiopsi for denne studien.
Mutasjonen i HTT-proteingenet fører til forlengelse av polyglutaminkanalen3. HTT har en rolle i slike cellulære prosesser som endokytose4, celletransport1,2, proteinforringelse5, etc. En betydelig del av disse prosessene involverer ulike elementer i cellecytoskjelettet, inkludert mikrotubulene.
Menneskelige primærceller er den beste modellen for å reprodusere hendelser som forekommer i pasientceller så nært som mulig. For å lage slike modeller må man isolere celler fra humant biopsimateriale (f.eks. fra kirurgiske prøver). Den resulterende primære cellelinjen er egnet til å studere patogenese ved hjelp av ulike genetiske, biokjemiske, molekylære og cellebiologiske metoder. Også menneskelige primære cellekulturer tjener som en forløper for å skape ulike transdifferensierte og transgene kulturer6.
Men i motsetning til udødelige cellekulturer er den betydelige ulempen ved primærceller deres begrensede passasjekapasitet. Derfor anbefaler vi å bruke celler i de tidlige passasjene (opptil 15). Eldre kulturer degener veldig raskt og mister sine unike egenskaper. Dermed bør de nylig oppnådde primærcellene holdes frosset for langsiktig lagring.
Primærcellekulturer er utsatt for dyrkingsforhold. Derfor krever de ofte unike tilnærminger og optimalisering av vekstforhold. Spesielt krever den menneskelige huden primære fibroblaster som brukes i våre eksperimenter på substratet. Derfor brukte vi forskjellige ekstra belegg (f.eks. gelatin eller fibronectin) avhengig av eksperimenttypen.
Cellecytoskjelettet bestemmer celleformen, mobiliteten og bevegelse. Dynamikken i cytoskjelettet er avgjørende for mange intracellulære prosesser både i interfase og mitose. Spesielt er cytoskjelettpolymerert fra tubulin svært dynamiske og polare strukturer, noe som muliggjør motorproteinmediert rettet intracellulær transport. Mikrotubulenes ender er i konstant omorganisering, monteringsfasene veksler med demonteringsfasene, og denne virkemåten kalles "dynamisk ustabilitet"7,8,9. Ulike tilknyttede proteiner skifter likevekten av polymerisasjonsreaksjonen, noe som fører enten til polymerformasjonen eller proteinmonomerformasjonen. Tilsetningen av tubulinunderenheter skjer hovedsakelig i pluss-enden av mikrotubuler10. End-bindende (EB) proteinfamilien består av tre medlemmer: EB1, EB2 og EB3. De tjener som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) og regulerer de dynamiske egenskapene til mikrotubuler ved å binde og stabilisere deres voksende pluss-ender11.
Mange studier bruker fluorescerende molekyl-merket tubulin mikroinjeksjon eller transfeksjon med tidsforløp avbildning og videoanalyse for å visualisere mikrotubuler in vitro. Disse metodene kan være invasive og skadelige for celler, spesielt primære menneskelige celler. Det mest utfordrende trinnet er å finne forhold for celletransfeksjon. Vi prøvde å nå høyest mulig nivå av transfeksjon uten å påvirke levedyktighet og innfødt cellemorfologi. Denne studien bruker den klassiske metoden for å studere forskjellene i mikrotubuldynamikk i hudfibroblaster av friske donorer og pasienter med Huntingtons sykdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Transfeksjon med et fluorescerende merket markørprotein av interesse i kombinasjon med tidsforløp videomikroskopi er en klassisk metode for å studere de dynamiske egenskapene til cytoskjelettet. Denne protokollen tilbyr en teknikk for menneskelig primær fibroblasttransfeksjon, noe som kan være vanskelig på grunn av spesifikasjonene til primære cellekultiveringsforhold. I tillegg krever cytoskeleton dynamisk egenskapsvedlikehold et lavt nivå av transfeksjon for å oppnå et godt signal-til-støy-forhold uten å forårsake mikrotubul stabilisering. Det er viktig å ta tiltak for å beskytte cellene mot lysindusert stress og fluorescerende fargestofffading. I løpet av vårt arbeid testet vi forskjellige transfeksjonsmetoder og protokoller, samt forskjellige vektorer for å velge den beste kombinasjonen av forhold som passer for menneskelige primære fibroblaststudier. Vi analyserte de resulterende intervallvideoene og beregnet mikrotubuldynamikk ved hjelp av ImageJ. Dynamikken i mikrotubulenes pluss-ender i de forskjellige celledelene er ikke like, så vi delte analysen i undergrupper - sentrosomområdet, lamellen og halen av fibroblaster. Spesielt kan denne protokollen brukes til in vitro-analyse av cytoskjelettdynamikk i pasientprøver, noe som muliggjør neste skritt mot å forstå dynamikken i de ulike sykdomsutviklingene.

De resulterende GFP-EB3-filmene som produseres ved hjelp av protokollen (figur 1), illustrerer mikrotubulenes dynamiske egenskaper. Mikrotubuler er involvert i ulike celleprosesser, og deres dynamiske egenskaper påvirker ulike livskarakteristikker for den primære menneskelige cellekulturen fra pasientens biopsimateriale (figur 2).
Følgende parametere bestemmer mikrotubulens dynamisk ustabilitet: veksthastigheten (polymerisasjon) og...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Denne protokollen er dedikert til mikrotubule plus-end visualisering av EB3 proteintransfeksjon for å studere deres dynamiske egenskaper i primærcellekulturen. Protokollen ble implementert på humane primære hudfibroblaster hentet fra pasienter med Huntington sykdom.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualisering i Huntingtons sykdomsmodell basert på humane primære hudfibroblaster

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Huntingtons sykdom, HS, er en uhelbredelig nevrodegenerativ patologi forårsaket av en mutasjon i genkoding av huntingtinprotein. Huntingtinet er først og fremst forbundet med vesicles og mikrotubuler, og sannsynligvis involvert i mikrotubule-avhengige transportprosesser. For å studere påvirkning av mutant huntingtin på dynamikken i mikrotubuler, brukte vi in vivo visualisering av EB3-protein, som regulerer mikrotubulens dynamiske egenskaper ved å bøye og stabilisere de voksende pluss endene.For å laste fluorescerende merket EB3 inn i humane hudfibroblaster, brukte vi plasmidtransfeksjon. Vi brukte den primære fibroblastkulturen for å få tak i EB3-pasientens hudbiopsi for denne studien. Lever biopsien til laboratoriet innen få timer i DMEM-medium, supplert med 15 mikrogram per milliliter penicillin og 50 enheter per milliliter streptomycin.Legg biopsivev i en seks centimeter Petri-tallerken, sammen med en liten mengde medium. Bruk en steril skalpell, kutt biopsiprøven i stykker ca 0,5 til en millimeter i størrelse. Plasser en, to, oppnådde fragmenter i en 3,5 centimeter Petri-tallerken, og legg et sterilt deksel over biopsistykkene.Tilsett sakte 1,5 milliliter av et vekstmedium. Kulturfiberblaster i vekstmediet i en CO2-inkubator, i 5% CO2 som er syv Centigrade, 80% fuktighet. Etter fire, syv dager, først keratinocytter, begynner fibroblaster å migrere fra vevet til bunnen av parabolen.Celle dyrking. For transfeksjonsvisualisering bør glass konfektplateretter, konfektretter brukes. Dekk parabolbunnen med autoklavert 0,1% gelatinoppløsning fremstilt i destillatvann.Inkuber i 15 minutter. Forbered kulturmediet. Bland grundig, lagre høyt på pluss 4 Centigrade.Varm mediet til pluss 37 Centigrade, før du legger til cellene. Vurder kulturen under mikroskopet. Fjern mediet, og vask cellene med en steril DPBS.Tilsett en milliliter forvarmet 0,25% trypsinoppløsning til cellene. Kontroller cellene under mikroskopet hvis de løsner helt fra substratet. Deaktiver trypsin med en milliliter av kulturmediet.Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 15 milliliter. Sentrifuger røret ved 200 G i fem minutter. Fjern supernatanten, resuspend cellepaletten i en milliliter av kulturmediet.Tell cellenummeret. Beregn det nødvendige antallet celler. Avfrø dem med en tetthet på åtte til 15, multiplisert med 10 til kraften til tre, passert med en centimeter.Dette panoreres i milliliter av kulturmediet. Fjern gelatinoppløsningen fra kulturretten som er forberedt på inokulering, og tilsett umiddelbart to milliliter av cellefjæringen. Dyrk fibroblaster på pluss 37 Centigrade i en CO2-inkubator.Oppdater mediet annenhver dag og fire dager. For eksperimenter, bruk cellene i fire, 11 passasjer. Ved transfeksjonstidspunktet bør samløpet ikke være mer enn 70, 80% Erstatt kulturmediet med en frisk 24 timer før transfeksjon.Forbered et DNA-lipidkompleks, basert på området og tettheten av cellesåingen. Liposomal transfeksjonsmiddel, og tettheten av cellesåingen av en, multiplisert med 10 til kraften til fire celler, passert med en centimeter ble brukt. Tilsett tre mikroliter kommersielt reagens til 125 mikroliter Opti-MEM, som ikke inneholder antibiotika.Uten å berøre rørveggene, forsiktig resuspend. Fortynn plasmid-DNA, GFP-EB3, og tilsett ett mikrogram av plasmid-DNA til 125 mikroliter OptiMEM. Forsiktig resuspend.Tilsett fortynnet plasmid DNA til hvert rør med fortynnet transfeksjonsreagens, ett til ett forhold. Inkuber i 30 minutter. Tilsett DNA lipidkomplekset til de seks centimeter Petri-retten med celler.Bland med en korsformet sving i 30 sekunder. Inkuber celler med transfeksjonsmiddel i 24 timer, og bytt deretter mediet til friskt. Analyser effektiviteten etter inspeksjon om 24 og 48 timer.Forbereder avbildning. Før levende avbildning av celler, endre kulturmediet til et medium uten PH-indikatorfarge for å redusere autofluorescence. Påfør mineralolje forsiktig på den mellomstore cellefasen for å dekke mediet helt, isolere det fra det ytre miljø for å redusere O2-penetrasjonen og middels fordampning.Bruk en makrolampe og alt bilde i 60-fold, 100-fold objektiv med høy tall blenderåpning for å ta bilde. For in viva observasjoner må mikroskopet være utstyrt med en inkubator for å opprettholde de nødvendige forholdene for cellene, inkludert å treffe det optiske bordet, og linsen til å passere 37 Centigrade, et lukket kammer var CO2-forsyning og fuktighetsnivåstøtte. Plasser den konfekte parabolen med cellene i mikroskopets holder før avbildning.Pass på at parabolen og kameraet er godt festet til holderen for å unngå å drive mens du tar bilder. Angi bildeparameterne. Velg de lave eksponeringsverdiene, siden lysbildet induserer celleskadelig, reagerer med oksygenrom.For å studere dynamikken i mikrotubuler i menneskelig hudfibroblaster, valgte vi en 300 millisekunders eksponering. Fokuser på gjenstanden av interesse. For lang tid, tidsforløp bildebehandling, det automatiske fokusstabiliseringssystemet, er perfekt fokussystem nødvendig, siden det kan være et skifte langs den angitte aksen, og gjenstanden for interesse vil dermed være ute av fokus.Velg de optimale bildeforholdene, avhengig av cellens fotosensitivitet og frekvensen av fakkelkromtoningen. Siden mikrotubuler er svært dynamiske strukturer, er rimelig kort tid i sin tur kan velges, og bildefrekvensen må være tilstrekkelig høy. For å undersøke mikrotubuldynamikken i hudfibroblaster brukte vi en frekvens på en ramme per sekund, i tre, fem minutter.Når du velger neste objekt for å få bilde, flytt bort fra det allerede avbildet området, siden det er en forløpbar fotoblødning under påvirkning av lys. Siden vi brukte en relativt høy bildefrekvens, lukket lukkeren ikke mellom bildene, og lampen var sent ute i hele bildeperioden, noe som er falmende økt. Velg de optimale videoene for å studere mikrotubuldynamikken visuelt, med tanke på kvaliteten på transfeksjonen, kvaliteten på mikrotubulenes bilder, optimalt signal-til-støy-forhold og fraværet av drifting av analysert celle.Bruk de valgte videoene til å studere mikrotubules plus-ends dynamikken, ved å trussing dem i Fiji-programmet. Det mest kritiske trinnet i protokollen er transfeksjon, noe som sikrer tilstrekkelig proteinuttrykk. Godt signal-til-støy-forhold, ingen fotobleking av mikrotubuler og fravær av celledrift er avgjørende for avbildning.In vivo visualisering av mikrotubule dynamikken gir viktig informasjon om egenskapene til mutant huntingtin. Vår protokoll kan brukes på studier av andre sykdommer, hvis patologi impliserer dynamiske egenskaper av cytoskjelett.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase aktivitet på subcellulære nivå og på Tidsskala sekunder i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En Full huddefekt modell for å evaluere vaskularisering av biomaterialer<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikrofluid Flow Chamber Modell for platetransfusjon og Hemostase Måler blodplateavleiring og fibrindannelse i sanntid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...