Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, concedendo o nº 075-15-2019-1669 (transfecção de fibroblastos), pela Fundação Russa de Ciência, conceder nº 19-15-00425 (todos os outros trabalhos sobre o cultivo de fibroblastos in vitro). Foi parcialmente apoiado pelo programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou, PNR5.13 (imagem e análise). Os autores reconhecem o apoio do Centro de Excelência Nikon do Instituto A. N. Belozersky de Biologia Físico-Química. Queremos oferecer nossos agradecimentos especiais a Ekaterina Taran por sua ajuda com a dublagem. Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.

Este protocolo segue as diretrizes do Centro Federal de Pesquisa e Clínica de Medicina Físico-Química da Agência Federal de Biologia Médica datada de 08 de setembro de 2015.
NOTA: A Figura 1 dá uma visão geral do protocolo.
1. Obtenção de uma cultura primária de fibroblastos de pele humana (Figura2)
<ol><li>Entregue a biópsia em um laboratório dentro de alguma...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Melhores resultados de qualidade para a análise dinâmica dos microtúbulos podem ser obtidos a partir de imagens microscópicas de alta qualidade. É importante observar todas as condições necessárias para a imagem de lapso de tempo das células vivas e ajustar corretamente os parâmetros de imagem. Usar pratos especiais de cultura celular com fundo de vidro (pratos confocal) é importante, já que o vidro tem um índice de luz refrativo diferente do plástico. A espessura do vidro e sua uniformidade sobre toda a su...

A doença de Huntington (HD) é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma proteína de codificação genética de codificação de genes (HTT). O HTT está associado principalmente a vesículas e microtúbulos e provavelmente está envolvido em processos de transporte dependentes de microtúbulos1,2. Para estudar a influência do HTT mutante na dinâmica dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vitro da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando o crescimento de plus-ends. Para carregar eb3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, foi aplicada transfecção plasmida. Utilizou-se a cultura do fibroblasto primário obtida a partir da biópsia da pele dos pacientes HD para este estudo.
A mutação no gene da proteína HTT leva ao alongamento do trato de poliglutamina3. O HTT tem um papel em processos celulares como a endocitose4,transporte celular1,2,degradação proteica5,etc. Parte substancial desses processos envolve vários elementos do citoesqueleto celular, incluindo os microtúbulos.
As células primárias humanas são o melhor modelo para reproduzir eventos que ocorrem em células do paciente o mais próximo possível. Para criar tais modelos, é preciso isolar as células do material de biópsia humana (por exemplo, a partir de amostras cirúrgicas). A linha celular primária resultante é adequada para estudar a patogênese usando vários métodos genéticos, bioquímicos, moleculares e de biologia celular. Além disso, as culturas celulares primárias humanas servem como precursora da criação de várias culturas transdiferenciadas e transgênicas6.
No entanto, em contraste com as culturas celulares imortalizadas, a desvantagem significativa das células primárias é sua capacidade limitada de passagem. Por isso, recomendamos o uso de células na fase de passagens iniciais (até 15). Culturas mais antigas degeneram muito rapidamente, perdendo suas propriedades únicas. Assim, as células primárias recém-obtidas devem ser mantidas congeladas para armazenamento a longo prazo.
As culturas celulares primárias são suscetíveis às condições de cultivo. Portanto, muitas vezes requerem abordagens únicas e otimização de condições de crescimento. Em particular, os fibroblastos primários da pele humana usados em nossos experimentos são exigentes no substrato. Assim, utilizamos vários revestimentos adicionais (por exemplo, gelatina ou fibronectina) dependendo do tipo de experimento.
O citoesqueleto celular determina a forma da célula, mobilidade e locomoção. A dinâmica do citoesqueleto é crucial para muitos processos intracelulares tanto na interfase quanto na mitose. Em particular, o citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, são estruturas altamente dinâmicas e polares, permitindo o transporte intracelular direcionado mediado por proteína motora. As extremidades dos microtúbulos estão em constante rearranjo, suas fases de montagem se alternam com as fases de desmontagem, e esse comportamento é chamado de "instabilidade dinâmica"7,8,9. Várias proteínas associadas mudam o equilíbrio da reação de polimerização, levando à formação do polímero ou à formação de monômeros proteicos. A adição de subunidades de tubulina ocorre principalmente na extremidade mais alta dos microtúbulos10. A família de proteínas end-binding (EB) é composta por três membros: EB1, EB2 e EB3. Eles servem como proteínas de rastreamento plus-end (+TIPs) e regulam as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando seus plus-endscrescentes 11.
Muitos estudos usam microinjeção ou transfecção de tubulina com imagem de lapso de tempo e análise de vídeo para visualizar microtúbulos in vitro. Esses métodos podem ser invasivos e prejudiciais às células, especialmente as células humanas primárias. O passo mais desafiador é encontrar condições para transfecção celular. Tentamos alcançar o mais alto nível possível de transfecção sem afetar a viabilidade e a morfologia celular nativa. Este estudo aplica o método clássico para estudar as diferenças na dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele de doadores saudáveis e pacientes com a doença de Huntington.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Transfecção com uma proteína marcadora fluorescente de interesse em combinação com microscopia de vídeo de lapso de tempo é um método clássico de estudar as propriedades dinâmicas do citoesqueleto. Este protocolo oferece uma técnica para transfecção do fibroblasto primário humano, que pode ser difícil devido às especificidades das condições primárias de cultivo celular. Além disso, a manutenção da propriedade dinâmica do citoesqueleto requer um baixo nível de transfecção para obter uma boa relação sinal-ruído sem causar estabilização de microtúbulos. É importante tomar medidas para proteger as células contra o estresse induzido pela luz e o desbotamento do corante fluorescente. No decorrer do nosso trabalho, testamos diferentes métodos e protocolos de transfecção, bem como diferentes vetores para selecionar a melhor combinação de condições adequadas para estudos de fibroblasto primário humano. Analisamos os vídeos resultantes do lapso de tempo e a dinâmica calculada de microtúbulos usando ImageJ. A dinâmica dos plus-ends dos microtúbulos nas diferentes partes celulares não são semelhantes, por isso dividimos a análise em subgrupos - a região centro-grande, a lamella e a cauda dos fibroblastos. Notavelmente, este protocolo pode ser usado para análise in vitro da dinâmica do citoesqueleto em amostras de pacientes, permitindo o próximo passo para entender a dinâmica do desenvolvimento de várias doenças.

Os filmes GFP-EB3 resultantes produzidos usando o protocolo (Figura 1) ilustram as propriedades dinâmicas dos microtúbulos. Os microtúbulos estão envolvidos em diferentes processos celulares, e suas propriedades dinâmicas impactam várias características de vida da cultura celular humana primária a partir do material de biópsia dos pacientes(Figura 2).
Os seguintes parâmetros determinam a instabilidade dinâmica dos microtúb...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Este protocolo é dedicado à visualização plus-end do microtúbulo pela transfecção de proteínaS EB3 para estudar suas propriedades dinâmicas na cultura celular primária. O protocolo foi implementado em fibroblastos de pele primários humanos obtidos de pacientes com a doença de Huntington.

Visualização da dinâmica plus-end de microtúbulo no modelo de doença de Huntington baseado em fibroblastos de pele primárias humanas

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

A doença de Huntington, HD, é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma mutação na proteína de caça de codificação genética. A huntingtin está associada principalmente a vesículas e microtúbulos, e provavelmente envolvida em processos de transporte dependentes de microtúbulos. Para estudar a influência da caça mutante no dinamismo dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vivo da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, dobrando e estabilizando o crescimento de plus-ends.Para carregar EB3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, aplicamos transfecção plasmida. Utilizamos a cultura do fibroblasto primário para obter a partir da biópsia de pele do paciente EB3 para este estudo. Entregue a biópsia em laboratório dentro de algumas horas em meio DMEM, suplementada com 15 microgramas por mililitro de penicilina, e 50 unidades por mililitro de estreptomicina.Coloque tecido de biópsia em uma placa de Petri de seis centímetros, juntamente com uma pequena quantidade de meio. Usando um bisturi estéril, corte a amostra de biópsia em pedaços de cerca de 0,5 a um milímetro de tamanho. Coloque um, dois, obteve fragmentos em uma placa de Petri de 3,5 centímetros, e coloque uma tampa estéril sobre as peças de biópsia.Adicione lentamente 1,5 mililitros de um meio de crescimento. Fibras culturais no meio de crescimento em uma incubadora de CO2, em 5% de CO2 que é de sete centígrados, 80% de umidade. Depois de quatro, sete dias, primeiro queratinócitos, então os fibroblastos começam a migrar do tecido para o fundo do prato.Cultivo de células. Para visualização de transfecção, pratos de placa confocal de vidro, pratos confocal devem ser usados. Cubra o fundo do prato com solução de gelatina autoclaved 0,1% preparada em água destilada.Incubar por 15 minutos. Prepare o meio de cultura. Misture bem, armazene alto em mais 4 centígrados.Aqueça o médio para mais 37 centígrados, antes de adicionar às células. Avalie a cultura sob o microscópio. Remova o meio e lave as células com um DPBS estéril.Adicione um mililitro de solução pré-aquecida de 0,25% de trippsina às células. Verifique as células sob o microscópio se elas se desprendem completamente do substrato. Desativar trippsina com um mililitro do meio de cultura.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 G por cinco minutos. Remova o supernatante, resuspense a paleta celular em um mililitro do meio de cultura.Conte o número do celular. Calcule o número necessário de células. Desemarmá-los com uma densidade de oito a 15, multiplicado por 10 ao poder de três, passou por um centímetro.Isso é garimpado em mililitros do meio cultural. Remova a solução de gelatina do prato de cultura preparado para a inoculação e adicione imediatamente dois mililitros da suspensão celular. Cultivar fibroblastos a mais de 37 centígrados em uma incubadora de CO2.Refrescar o meio a cada dois, quatro dias. Para experimentos, use as células de quatro, 11 passagens. No momento da transfecção, a confluência não deve ser superior a 70, 80% Substitua o meio de cultura por um fresco 24 horas antes da transfecção.Prepare um complexo dna-lipíde, baseado na área e densidade da semeadura celular. Agente de transfecção liposômica, e a densidade da semeadura celular de uma, multiplicada por 10 ao poder de quatro células, passou por um centímetro foi usada. Adicione três microliters de reagente comercial a 125 microliters de Opti-MEM, sem antibiótico.Sem tocar nas paredes do tubo, resuspenque suavemente. Dna plasmídeo diluído, GFP-EB3, adicionando um micrograma do DNA plasmídeo a 125 microliters de OptiMEM. Levemente resuspend.Adicione DNA plasmídeo diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído, de uma a uma razão. Incubar por 30 minutos. Adicione o complexo lipídico de DNA à placa de Petri de seis centímetros com células.Misture com um balanço cruciforme por 30 segundos. Incubar células com um agente de transfecção por 24 horas e, em seguida, mudar o médio para o fresco. Analise a eficiência após a inspeção em 24 e 48 horas.Preparando-se para a imagem. Antes da imagem viva das células, mude o meio de cultura para um meio sem corante indicador PH para reduzir a autofluorescência. Aplique cuidadosamente o óleo mineral na fase média celular para cobrir completamente o meio, isolando-o do ambiente externo para reduzir a penetração de O2 e a evaporação média.Use uma lâmpada macro e toda a imagem em 60 vezes, 100 vezes lente objetiva com alta abertura numélica para tirar imagem. Para observações vivas, o microscópio deve ser equipado com uma incubadora para manter as condições necessárias para as células, incluindo bater na mesa óptica, e a lente para passar de 37 Centígrados, uma câmara fechada foi fornecimento de CO2 e suporte ao nível de umidade. Coloque a folha confocal com as células no suporte do microscópio antes da imagem.Certifique-se de que o prato e a câmera estão bem ligados ao suporte para evitar a deriva enquanto tira imagens. Definindo os parâmetros de imagem. Escolha os baixos valores de exposição, uma vez que o slide induz danos às células, reage com espaços de oxigênio.Para estudar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele humana, selecionamos uma exposição de 300 milissegundos. Concentre-se no objeto de interesse. Para imagens de longo prazo, lapso de tempo, o sistema automático de estabilização de foco, sistema de foco perfeito é necessário, uma vez que pode haver uma mudança ao longo do eixo definido, e o objeto de interesse estará, portanto, fora de foco.Escolha as condições de imagem ideais, dependendo da fotosensibilidade da célula e da taxa de desbotamento cromado do sinalizador. Uma vez que os microtúbulos são estruturas altamente dinâmicas, são razoavelmente curtos tempo, por sua vez, pode ser selecionado, e a taxa de quadros deve ser suficientemente alta. Para investigar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele, utilizamos uma frequência de um quadro por segundo, por três, cinco minutos.Ao selecionar o próximo objeto para obter imagem, afaste-se da área já imagemizada, já que sob a influência da luz, há uma foto-sangramento decorrido. Como usamos uma frequência de imagem relativamente alta, o obturador não fechou entre as imagens, e a lâmpada estava atrasada durante todo o período de imagem, que está desaparecendo. Escolha os vídeos ideais para estudar a dinâmica do microtúbulo visualmente, levando em conta a qualidade da transfecção, a qualidade das imagens dos microtúbulos, a relação sinal-ruído ideal e a ausência de deriva da célula analisada.Use os vídeos selecionados para estudar a dinâmica de microtúbulos plus-ends, amarrando-os no programa Fiji. O passo mais crítico do protocolo é a transfecção, garantindo expressão proteica suficiente. Uma boa relação sinal-ruído, sem fotobleaching de microtúbulos, e ausência de drifting celular são críticos para a imagem.A visualização in vivo da dinâmica dos microtúbulos fornece informações vitais sobre as propriedades da caça mutante. Nosso protocolo pode ser aplicado a estudos de outras doenças, cuja patologia implica propriedades dinâmicas do citoesqueleto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengenharia

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

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A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

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A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...