Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Данное исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1669 (трансфекция фибробластов), Российским научным фондом, грант No 19-15-00425 (все остальные работы по выращиванию фибробластов in vitro). Она была частично поддержана программой развития МГУ им. М.В. Ломоносова PNR5.13 (визуализация и анализ). Авторы признают поддержку Центра передового опыта «Никон» при Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Мы хотим выразить особую благодарность Екатерине Таран за помощь в озвучивании. Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.

Данный протокол соответствует рекомендациям Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства от 08 сентября 2015 года.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола.
<strong...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Более качественные результаты анализа динамики микротрубочек могут быть получены из высококачественных микроскопических изображений. Важно соблюдать все необходимые условия для покадровой визуализации живых клеток и правильно корректировать параметры визуализации. Важно использ?...

Болезнь Гентингтона (БГ) является неизлечимой нейродегенеративной патологией, вызванной геном мутации, кодирующим белок хунтингтина (HTT). HTT в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в микротрубочезависимых транспортных процессах1,2. Для изучения влияния мутантного HTT на динамику микротрубочек мы использовали визуализацию in vitro белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем связывания и стабилизации растущих плюсов. Для загрузки флуоресцентно меченого EB3 в фибробласты кожи человека применяли плазмидную трансфекцию. Для этого исследования мы использовали первичную культуру фибробластов, полученную из биопсии кожи пациентов с БГ.
Мутация в гене белка HTT приводит к удлинению полиглутаминового тракта3. HTT играет роль в таких клеточных процессах, как эндоцитоз4,клеточный транспорт1,2,деградация белка5и др. Существенная часть этих процессов включает в себя различные элементы клеточного цитоскелета, в том числе и микротрубочки.
Первичные клетки человека являются лучшей моделью для максимально точного воспроизведения событий, происходящих в клетках пациента. Для создания таких моделей необходимо изолировать клетки из биопсийного материала человека (например, из хирургических образцов). Полученная первичная клеточная линия подходит для изучения патогенеза с использованием различных генетических, биохимических, молекулярных и клеточных методов биологии. Также первичные клеточные культуры человека служат предшественником для создания различных трансдифференцированных и трансгенных культур6.
Однако, в отличие от увековеченных клеточных культур, существенным недостатком первичных клеток является их ограниченная проходная способность. Поэтому мы рекомендуем использовать клетки на ранней стадии прохождения (до 15). Старые культуры очень быстро вырождаются, теряя свои уникальные свойства. Таким образом, вновь полученные первичные клетки следует хранить замороженными для длительного хранения.
Первичные клеточные культуры восприимчивы к условиям культивирования. Поэтому они часто требуют уникальных подходов и оптимизации условий выращивания. В частности, первичные фибробласты кожи человека, используемые в наших экспериментах, требовательны к субстрату. Следовательно, мы использовали различные дополнительные покрытия (например, желатин или фибронектин) в зависимости от типа эксперимента.
Клеточный цитоскелет определяет форму клетки, подвижность и локомоцию. Динамика цитоскелета имеет решающее значение для многих внутриклеточных процессов как в интерфазе, так и при митозе. В частности, цитоскелеты, полимеризованные из тубулина, обладают высокодинамичными и полярными структурами, обеспечивающими моторный белково-опосредованный направленный внутриклеточный транспорт. Концы микротрубочек находятся в постоянной перестановке, фазы их сборки чередуются с фазами разборки, и такое поведение называется «динамической нестабильностью»7,8,9. Различные ассоциированные белки смещают равновесие реакции полимеризации, приводя либо к образованию полимера, либо к образованию белкового мономера. Добавление субъединиц тубулина происходит в основном на плюс-конце микротрубочек10. Семейство конечных связывающих (EB) белков состоит из трех членов: EB1, EB2 и EB3. Они служат плюс-концевыми белками (+ТИПы) и регулируют динамические свойства микротрубочек, связывая и стабилизируя их растущие плюс-концы11.
Во многих исследованиях используется микроинъекция или трансфекция флуоресцентных молекул тубулина с покадровой визуализацией и видеоанализом для визуализации микротрубочек in vitro. Эти методы могут быть инвазивными и вредными для клеток, особенно первичных клеток человека. Наиболее сложным шагом является поиск условий для трансфекции клеток. Мы попытались достичь максимально возможного уровня трансфекции, не влияя на жизнеспособность и морфологию нативных клеток. В данном исследовании применяется классический метод изучения различий в динамике микротрубочек в фибробластах кожи здоровых доноров и пациентов с болезнью Гентингтона.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Трансфекция флуоресцентно меченым маркерным белком, представляющим интерес, в сочетании с покадровой видеомикроскопией является классическим методом изучения динамических свойств цитоскелета. Этот протокол предлагает технику первичной трансфекции фибробластов человека, которая может быть затруднена из-за специфики условий культивирования первичных клеток. Кроме того, поддержание динамических свойств цитоскелета требует низкого уровня трансфекции для получения хорошего отношения сигнал/шум, не вызывая стабилизации микротрубочек. Важно принять меры по защите клеток от светового стресса и флуоресцентного затухания красителей. В ходе нашей работы мы протестировали различные методы и протоколы трансфекции, а также различные векторы, чтобы выбрать наилучшую комбинацию условий, подходящих для исследований первичных фибробластов на людях. Мы проанализировали полученные покадровые видео и рассчитали динамику микротрубочек с помощью ImageJ. Динамика плюсов микротрубочек в разных частях клеток не одинакова, поэтому мы разделили анализ на подгруппы — центросомную область, пластинку и хвост фибробластов. Примечательно, что этот протокол может быть использован для анализа in vitro динамики цитоскелетов в образцах пациентов, что позволяет сделать следующий шаг к пониманию динамики развития различных заболеваний.

Полученные фильмы GFP-EB3, созданные с использованием протокола(рисунок 1),иллюстрируют динамические свойства микротрубочек. Микротрубочки участвуют в различных клеточных процессах, и их динамические свойства влияют на различные жизненные характеристики первичной куль?...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Этот протокол предназначен для визуализации микротрубочек плюс конец путем трансфекции белка EB3 для изучения их динамических свойств в первичной клеточной культуре. Протокол был реализован на первичных фибробластах кожи человека, полученных от пациентов с болезнью Гентингтона.

Визуализация динамики микротрубочек Plus-End в модели болезни Гентингтона на основе первичных фибробластов кожи человека

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Болезнь Гентингтона, БГ, является неизлечимой, нейродегенеративной патологией, вызванной мутацией в гене, кодирующем белок гентингтина. Гентингтин в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в процессах переноса, зависящих от микротрубочек. Для изучения влияния мутантного гентингтина на динамизм микротрубочек мы использовали визуализацию in vivo белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем изгиба и стабилизации растущих плюс-эндов.Чтобы загрузить флуоресцентно меченый EB3 в фибробласты кожи человека, мы применили трансфекцию плазмид. Мы использовали первичную культуру фибробластов для получения биопсии кожи пациента с EB3 для этого исследования. Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде DMEM, дополненной 15 микрограммом на миллилитр пенициллина и 50 единицами на миллилитр стрептомицина.Поместите биопсию ткани в шестисантиметровую чашку Петри вместе с небольшим количеством среды. Используя стерильный скальпель, разрежьте образец биопсии на кусочки размером от 0,5 до одного миллиметра. Поместите один, два, полученных фрагмента в чашку Петри размером 3,5 сантиметра, а поверх кусочков биопсии поместите стерильную крышку.Медленно добавляют 1,5 миллилитра питательной среды. Культивируйте волокнистые слоисты в питательной среде в CO2-инкубаторе, в 5% CO2, что составляет семь градусов по Цельсию, влажность 80%. Через четыре, семь дней сначала кератиноциты, затем фибробласты начинают мигрировать из ткани на дно тарелки.Культивирование клеток. Для трансфекционной визуализации следует использовать стеклянные конфокальные тарелки, конфокальные тарелки. Накройте дно тарелки автоклавным 0,1% раствором желатина, приготовленным в дистиллятной воде.Инкубировать в течение 15 минут. Подготовьте культуральную среду. Тщательно перемешайте, храните при температуре плюс 4 по Цельсию.Нагрейте среду до плюс 37 по Цельсию, прежде чем добавлять в клетки. Оцените культуру под микроскопом. Удалите среду и промойте клетки стерильным DPBS.Добавьте в клетки один миллилитр предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина. Проверьте клетки под микроскопом, если они полностью отсоединяются от подложки. Деактивировать трипсин одним миллилитром питательной среды.Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте трубку при 200 G в течение пяти минут. Удалите супернатант, повторно суспендируйте клеточную палитру в одном миллилитре питательной среды.Подсчитайте номер ячейки. Рассчитайте необходимое количество ячеек. Сеяют их с плотностью от восьми до 15, умножают на 10 в степени трех, проходят на сантиметр.Его панируют в миллилитрах питательной среды. Вынуть желатиновый раствор из культуральной посуды, подготовленной для посева, и сразу же добавить два миллилитра клеточной суспензии. Культивируйте фибробласты при температуре плюс 37 градусов по Цельсию в CO2-инкубаторе.Обновляйте среду каждые два, четыре дня. Для экспериментов используют клетки из четырех, 11 проходов. К моменту трансфекции слияние должно составлять не более 70,80% Заменить питательную среду свежей за 24 часа до трансфекции.Готовят ДНК-липидный комплекс, исходя из площади и плотности посева клеток. Использовался липосомальный трансфекционный агент, а плотность посева клеток одной, умноженной на 10 до степени четырех клеток, пройденных на сантиметр. Добавьте три микролитра коммерческого реагента к 125 микролитрам Opti-MEM, не содержащим антибиотика.Не касаясь стенок трубки, аккуратно повторно суспендировать. Разбавляют плазмидную ДНК, GFP-EB3, добавляя один микрограмм плазмидной ДНК к 125 микролитрам OptiMEM. Осторожно повторно суспендировать.Добавьте разбавленную плазмидную ДНК в каждую пробирку разбавленного трансфекционного реагента в соотношении один к одному. Инкубировать в течение 30 минут. Добавьте липидный комплекс ДНК в шестисантиметровую чашку Петри с клетками.Перемешайте крестообразным взмахом в течение 30 секунд. Инкубировать клетки с трансфекционным агентом в течение 24 часов, затем изменить среду на свежую. Анализ эффективности после осмотра через 24 и 48 часов.Подготовка к визуализации. Перед живой визуализацией клеток измените культуральную среду на среду без индикаторного красителя PH, чтобы уменьшить автофлуоресценцию. Осторожно нанесите минеральное масло на среднюю клеточную фазу, чтобы полностью покрыть среду, изолируя ее от внешней среды, чтобы уменьшить проникновение O2 и испарение среды.Используйте макролампу и все изображение в 60-кратном, 100-кратном объективе с высокой цифровой диафрагмой для получения изображения. Для наблюдений в viva микроскоп должен быть оснащен инкубатором для поддержания необходимых условий для клеток, включая попадание в оптический стол, и линзой, чтобы пройти 37 градусов по Цельсию, закрытая камера была подачей CO2 и поддержкой уровня влажности. Поместите конфокальную чашку с клетками в держатель микроскопа перед визуализацией.Убедитесь, что тарелка и камера надежно прикреплены к держателю, чтобы избежать дрейфа во время съемки. Настройка параметров изображения. Выбирайте низкие значения экспозиции, так как скольжение вызывает повреждение клеток, реагирует с кислородными пространствами.Для изучения динамики микротрубочек в фибробластах кожи человека мы выбрали экспозицию 300 миллисекунд. Сосредоточьтесь на интересующем объекте. Для длительной, покадровой съемки необходима система автоматической стабилизации фокусировки, идеальная система фокусировки, так как может произойти сдвиг вдоль заданной оси, и интересующий объект таким образом окажется вне фокуса.Выберите оптимальные условия визуализации в зависимости от светочувствительности клетки и скорости затухания бликового хрома. Поскольку микротрубочки являются высокодинамичными структурами, то достаточно короткое время в свою очередь можно выбрать, а частота кадров должна быть достаточно высокой. Чтобы исследовать динамику микротрубочек в фибробластах кожи, мы использовали частоту один кадр в секунду, в течение трех, пяти минут.При выборе следующего объекта для получения изображения отойдите от уже изображенной области, так как под воздействием света происходит затухающее фотопролитие. Поскольку мы использовали относительно высокую частоту изображения, затвор не закрывался между изображениями, и лампа опаздывала на весь период съемки, который при затухании увеличивался. Выбрать оптимальные видеоролики для визуального изучения динамики микротрубочек с учетом качества трансфекции, качества изображений микротрубочек, оптимального отношения сигнал/шум и отсутствия дрейфа анализируемой ячейки.Используйте выбранные видеоролики для изучения динамики микротрубочек плюс-эндов, путем их стропания в программе Фиджи. Наиболее важным этапом в протоколе является трансфекция, обеспечивающая достаточную экспрессию белка. Хорошее соотношение сигнал/шум, отсутствие фотоотбеливания микротрубочек и отсутствие дрейфа клеток имеют решающее значение для визуализации.Визуализация in vivo динамики микротрубочек дает жизненно важную информацию о свойствах мутантного гентингтина. Наш протокол может быть применен к исследованиям других заболеваний, патология которых подразумевает динамические свойства цитоскелета.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Полный кожи Дефект Модель для оценки васкуляризации биоматериалов<em&gt; В Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Микрожидком Flow камера Модель тромбоцитами трансфузиологии и гемостаза меры тромбоцитов Отложение и фибрина Формирование в режиме реального времени

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...