Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa, subvención No. 075-15-2019-1669 (transfección de fibroblastos), por la Fundación Rusa de Ciencias, subvención No. 19-15-00425 (todos los demás trabajos sobre el cultivo de fibroblastos in vitro). Fue parcialmente apoyado por el programa de desarrollo de la Universidad Estatal de Moscú Lomonosov PNR5.13 (imágenes y análisis). Los autores reconocen el apoyo del Centro de Excelencia Nikon en el Instituto A. N. Belozersky de Biología Físico-Química. Queremos ofrecer nuestro agradecimiento especial a Ekaterina Taran por su ayuda con la actuación de voz. Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.

Este protocolo sigue las directrices del Centro Federal de Investigación y Clínica de Medicina Físico-Química de la Agencia Federal Médica Biológica de fecha 08 de septiembre de 2015.
NOTA: La Figura 1 ofrece una visión general del protocolo.
1. Obtención de un cultivo primario de fibroblastos de piel humana (Figura2)
<ol><li>Entregue la biopsia a un laboratorio e...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Se pueden obtener resultados de mejor calidad para el análisis dinámico de microtúbulos a partir de imágenes microscópicas de alta calidad. Es importante observar todas las condiciones necesarias para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas y ajustar correctamente los parámetros de la imagen. El uso de platos especiales de cultivo celular con un fondo de vidrio (platos confocales) es importante, ya que el vidrio tiene un índice de refracción de la luz diferente al plástico. El grosor ...

La enfermedad de Huntington (EH) es una patología neurodegenerativa incurable causada por un gen mutacionina que codifica la proteína cazadora (HTT). La HTT se asocia principalmente con vesículas y microtúbulos y probablemente esté involucrada en procesos de transporte dependientes de microtúbulos1,2. Para estudiar la influencia de la HTT mutante en la dinámica de los microtúbulos, utilizamos la visualización in vitro de la proteína EB3, que regula las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando los extremos superiores en crecimiento. Para cargar EB3 marcado fluorescentemente en fibroblastos de piel humana, se aplicó transfección por plásmido. Para este estudio se utilizó el cultivo primario de fibroblastos obtenido de la biopsia de piel de los pacientes con EH.
La mutación en el gen de la proteína HTT conduce a la elongación del tracto de la poliglutamina3. HTT tiene un papel en procesos celulares tales como endocitosis4,transporte celular1,2,degradación deproteínas 5,etc. Una parte sustancial de estos procesos involucra varios elementos del citoesqueleto celular, incluidos los microtúbulos.
Las células primarias humanas son el mejor modelo para reproducir los eventos que ocurren en las células de los pacientes lo más cerca posible. Para crear tales modelos, uno necesita aislar células de material de biopsia humana (por ejemplo, de muestras quirúrgicas). La línea celular primaria resultante es adecuada para estudiar la patogénesis utilizando varios métodos genéticos, bioquímicos, moleculares y de biología celular. Además, los cultivos celulares primarios humanos sirven como precursores para la creación de diversos cultivos transdiferenciados y transgénicos6.
Sin embargo, a diferencia de los cultivos celulares inmortalizados, la desventaja significativa de las células primarias es su limitada capacidad de paso. Por lo tanto, recomendamos el uso de células en la etapa de pasajes tempranos (hasta 15). Las culturas más antiguas degeneran muy rápidamente, perdiendo sus propiedades únicas. Por lo tanto, las células primarias recién obtenidas deben mantenerse congeladas para su almacenamiento a largo plazo.
Los cultivos celulares primarios son susceptibles a las condiciones de cultivo. Por lo tanto, a menudo requieren enfoques únicos y optimización de las condiciones de crecimiento. En particular, los fibroblastos primarios de la piel humana utilizados en nuestros experimentos son exigentes con el sustrato. Por lo tanto, utilizamos varios recubrimientos adicionales (por ejemplo, gelatina o fibronectina) dependiendo del tipo de experimento.
El citoesqueleto celular determina la forma celular, la movilidad y la locomoción. La dinámica del citoesqueleto es crucial para muchos procesos intracelulares tanto en interfase como en mitosis. En particular, el citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, son estructuras altamente dinámicas y polares, lo que permite el transporte intracelular dirigido mediado por proteínas motoras. Los extremos de los microtúbulos están en constante reordenamiento, sus fases de ensamblaje se alternan con las fases de desmontaje, y este comportamiento se denomina "inestabilidad dinámica"7,8,9. Varias proteínas asociadas cambian el equilibrio de la reacción de polimerización, lo que lleva a la formación de polímeros o a la formación de monómeros de proteínas. La adición de subunidades de tubulina ocurre principalmente en el extremo superior de los microtúbulos10. La familia de proteínas de unión al final (EB) consta de tres miembros: EB1, EB2 y EB3. Sirven como proteínas de seguimiento de extremos más (+TIP) y regulan las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando sus extremos superiores en crecimiento11.
Muchos estudios utilizan microinyección o transfección de tubulina marcada con moléculas fluorescentes con imágenes de lapso de tiempo y análisis de video para visualizar microtúbulos in vitro. Estos métodos pueden ser invasivos y dañinos para las células, especialmente las células humanas primarias. El paso más desafiante es encontrar las condiciones para la transfección celular. Intentamos alcanzar el nivel más alto posible de transfección sin afectar la viabilidad y la morfología celular nativa. Este estudio aplica el método clásico para estudiar las diferencias en la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel de donantes sanos y pacientes con enfermedad de Huntington.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

La transfección con una proteína marcadora de interés marcada fluorescentemente en combinación con videomicscopía de lapso de tiempo es un método clásico para estudiar las propiedades dinámicas del citoesqueleto. Este protocolo ofrece una técnica para la transfección de fibroblastos primarios humanos, que puede ser difícil debido a los detalles de las condiciones de cultivo de células primarias. Además, el mantenimiento de la propiedad dinámica del citoesqueleto requiere un bajo nivel de transfección para obtener una buena relación señal-ruido sin causar estabilización de microtúbulos. Es importante tomar medidas para proteger las células del estrés inducido por la luz y el desvanecimiento del tinte fluorescente. En el curso de nuestro trabajo, probamos diferentes métodos y protocolos de transfección, así como diferentes vectores para seleccionar la mejor combinación de condiciones adecuadas para estudios de fibroblastos primarios humanos. Analizamos los videos de lapso de tiempo resultantes y calculamos la dinámica de los microtúbulos utilizando ImageJ. La dinámica de los extremos positivos de los microtúbulos en las diferentes partes celulares no es similar, por lo que dividimos el análisis en subgrupos: la región del centrosoma, la lámina y la cola de los fibroblastos. En particular, este protocolo se puede utilizar para el análisis in vitro de la dinámica del citoesqueleto en muestras de pacientes, lo que permite el siguiente paso hacia la comprensión de la dinámica de los diversos desarrollos de la enfermedad.

Las películas GFP-EB3 resultantes producidas utilizando el protocolo (Figura 1) ilustran las propiedades dinámicas de los microtúbulos. Los microtúbulos están involucrados en diferentes procesos celulares, y sus propiedades dinámicas afectan varias características de vida del cultivo celular humano primario a partir del material de biopsia de los pacientes (Figura 2).
Los siguientes parámetros determinan la inestabilidad diná...

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Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Este protocolo está dedicado a la visualización de microtúbulos plus-end mediante transfección de proteínas EB3 para estudiar sus propiedades dinámicas en cultivo celular primario. El protocolo se implementó en fibroblastos primarios de piel humana obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington.

Visualización dinámica de microtúbulos plus-end en el modelo de la enfermedad de Huntington basado en fibroblastos primarios de piel humana

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

La enfermedad de Huntington, HD, es una patología neurodegenerativa incurable causada por una mutación en el gen que codifica la proteína huntingtina. La huntingtina se asocia principalmente con vesículas y microtúbulos, y probablemente está involucrada en procesos de transporte dependientes de microtúbulos. Para estudiar la influencia de la huntingtina mutante en el dinamismo de los microtúbulos, utilizamos la visualización in vivo de la proteína EB3, que regula las propiedades dinámicas de los microtúbulos doblando y estabilizando los extremos superiores en crecimiento.Para cargar EB3 marcado fluorescentemente en fibroblastos de piel humana, aplicamos transfección por plásmidos. Se utilizó el cultivo primario de fibroblastos para obtener de la biopsia de piel del paciente EB3 para este estudio. Entregue la biopsia al laboratorio en unas pocas horas en medio DMEM, complementado con 15 microgramos por mililitro de penicilina y 50 unidades por mililitro de estreptomicina.Coloque el tejido de la biopsia en una placa de Petri de seis centímetros, junto con una pequeña cantidad de medio. Usando un bisturí estéril, corte la muestra de biopsia en pedazos de aproximadamente 0.5 a un milímetro de tamaño. Coloque uno, dos fragmentos obtenidos en una placa de Petri de 3,5 centímetros y coloque un resbalón de cubierta estéril sobre las piezas de biopsia.Agregue lentamente 1.5 mililitros de un medio de crecimiento. Cultive los chorros de fibra en el medio de crecimiento en una incubadora de CO2, en un 5% de CO2 que es de siete grados centígrados, 80% de humedad. Después de cuatro, siete días, primero los queratinocitos, luego los fibroblastos comienzan a migrar del tejido al fondo del plato.Cultivo celular. Para la visualización de la transfección, se deben usar platos de placa confocal de vidrio, platos confocales. Cubra el fondo del plato con una solución de gelatina al 0,1% en autoclave preparada en agua destilada.Incubar durante 15 minutos. Preparar el medio de cultivo. Mezcle bien, almacene alto a más de 4 centígrados.Calentar el medio a más 37 centígrados, antes de añadirlo a las células. Evaluar el cultivo bajo el microscopio. Retire el medio y lave las células con un DPBS estéril.Agregue un mililitro de solución de tripsina al 0,25% precalentada a las células. Revise las células bajo el microscopio si se desprenden completamente del sustrato. Desactivar la tripsina con un mililitro del medio de cultivo.Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender la paleta celular en un mililitro del medio de cultivo.Cuente el número de celda. Calcule el número requerido de celdas. Dessiembrarlos con una densidad de ocho a 15, multiplicado por 10 a la potencia de tres, pasado por un centímetro.Esto se divide en mililitros del medio de cultivo. Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo preparada para la inoculación e inmediatamente agregue dos mililitros de la suspensión celular. Cultive fibroblastos a más de 37 grados centígrados en una incubadora de CO2.Refresque el medio cada dos, cuatro días. Para los experimentos, use las células de cuatro, 11 pasajes. En el momento de la transfección, la confluencia no debe ser más del 70, 80%Reemplace el medio de cultivo por uno fresco 24 horas antes de la transfección.Prepare un complejo ADN-lípido, basado en el área y la densidad de la siembra celular. Se utilizó el agente de transfección liposomal, y la densidad de la siembra celular de una, multiplicada por 10 a la potencia de cuatro células, pasadas por un centímetro. Agregue tres microlitros de reactivo comercial a 125 microlitros de Opti-MEM, que no contengan antibiótico.Sin tocar las paredes del tubo, resuspenda suavemente. ADN plásmido diluido, GFP-EB3, agregando un microgramo del ADN plásmido a 125 microlitros de OptiMEM. Resuspendir suavemente.Agregue ADN plásmido diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido, una a una proporción. Incubar durante 30 minutos. Agregue el complejo lipídico de ADN a la placa de Petri de seis centímetros con células.Mezclar con un columpio cruciforme durante 30 segundos. Incubar las células con un agente de transfección durante 24 horas, luego cambiar el medio a uno fresco. Analice la eficiencia después de la inspección en 24 y 48 horas.Preparación para la obtención de imágenes. Antes de obtener imágenes en vivo de las células, cambie el medio de cultivo a un medio sin colorante indicador de pH para reducir la autofluorescencia. Aplique cuidadosamente aceite mineral a la fase de celda media para cubrir completamente el medio, aislándolo del entorno externo para reducir la penetración de O2 y la evaporación del medio.Use una lámpara macro y toda la imagen en una lente de objetivo de 60 veces y 100 veces con alta apertura numérica para tomar la imagen. Para las observaciones in viva, el microscopio debe estar equipado con una incubadora para mantener las condiciones necesarias para que las células, incluido el golpeo de la mesa óptica, y la lente pase 37 grados centígrados, una cámara cerrada fue el suministro de CO2 y el soporte de nivel de humedad. Coloque el plato confocal con las células en el soporte del microscopio antes de obtener imágenes.Asegúrese de que el plato y la cámara estén bien conectados al soporte para evitar la deriva mientras se toman imágenes. Configuración de los parámetros de imagen. Elija los valores de exposición bajos, ya que la diapositiva induce el daño celular, reacciona con los espacios de oxígeno.Para estudiar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel humana, seleccionamos una exposición de 300 milisegundos. Centrarse en el objeto de interés. Para las imágenes de lapso de tiempo prolongado, el sistema de estabilización de enfoque automático, el sistema de enfoque perfecto es necesario, ya que puede haber un cambio a lo largo del eje establecido y, por lo tanto, el objeto de interés estará fuera de foco.Elija las condiciones óptimas de imagen, dependiendo de la fotosensibilidad de la célula y la velocidad de desvanecimiento del cromo de destello. Dado que los microtúbulos son estructuras altamente dinámicas, se puede seleccionar un tiempo razonablemente corto a su vez, y la velocidad de fotogramas debe ser lo suficientemente alta. Para investigar la dinámica de los microtúbulos en los fibroblastos de la piel, utilizamos una frecuencia de un fotograma por segundo, durante tres, cinco minutos.Al seleccionar el siguiente objeto para obtener la imagen, aléjese del área ya fotografiada, ya que bajo la influencia de la luz, hay un foto-sangrado que transcurre. Dado que utilizamos una frecuencia de imagen relativamente alta, el obturador no se cerró entre las imágenes, y la lámpara llegó tarde durante todo el período de imágenes, que se está desvaneciendo. Elija los videos óptimos para estudiar visualmente la dinámica de los microtúbulos, teniendo en cuenta la calidad de la transfección, la calidad de las imágenes de los microtúbulos, la relación óptima señal-ruido y la ausencia de deriva de la célula analizada.Utilice los videos seleccionados para estudiar la dinámica de los microtúbulos más-extremos, trussándolos en el programa de Fiji. El paso más crítico en el protocolo es la transfección, asegurando una expresión suficiente de proteínas. Una buena relación señal-ruido, la ausencia de fotoblanqueo de microtúbulos y la ausencia de deriva celular son fundamentales para la obtención de imágenes.La visualización in vivo de la dinámica de los microtúbulos proporciona información vital sobre las propiedades de la huntingtina mutante. Nuestro protocolo se puede aplicar a estudios de otras enfermedades, cuya patología implica propiedades dinámicas del citoesqueleto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

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