Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Denna forskning finansierades av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning, anslag nr 075-15-2019-1669 (transfection av fibroblaster), av Ryska vetenskapsstiftelsen, bidrag nr 19-15-00425 (alla andra arbeten om odling av fibroblaster in vitro). Det stöddes delvis av Lomonosov Moskva State University Development program PNR5.13 (imaging och analys). Författarna erkänner stödet från Nikon Center of Excellence vid A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi vill framföra vårt speciella tack till Ekaterina Taran för hennes hjälp med röstskådespeleri. Författarna tackar också Pavel Belikov för hans hjälp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet skapades med BioRender.com.

Detta protokoll följer riktlinjerna från Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency daterad 08 september 2015.
OBS: Figur 1 ger en översikt över protokollet.
1. Erhålla en primär kultur av human hud fibroblaster (figur2)
<ol><li>Leverera biopsin till ett laboratorium inom några timmar i Dulbeccos modified...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Bättre kvalitetsresultat för mikrotubulis dynamikanalys kan erhållas från högkvalitativa mikroskopiska bilder. Det är viktigt att iaktta alla nödvändiga förutsättningar för tidsfördröjning av levande celler och att korrekt justera bildparametrarna. Att använda speciella cellodlingsrätter med en glasbotten (konfokala rätter) är viktigt, eftersom glas har ett annat brytningsindex av ljus än plast. Glasets tjocklek och dess enhetlighet över hela dess område är också extremt viktigt, eftersom dessa para...

Huntingtons sjukdom (HD) är en obotlig neurodegenerativ patologi orsakas av en mutationin gen kodningtin protein (HTT). HTT är främst förknippat med blåsor och mikrotubuli och är troligen involverat i mikrotubuleberoende transportprocesser1,2. För att studera mutant HTT:s påverkan på mikrotubuledynamiken använde vi in vitro-visualisering av EB3-proteinet, som reglerar mikrotubulis dynamiska egenskaper genom att binda och stabilisera de växande plus-ändarna. För att ladda fluorescerande märkt EB3 i mänskliga huden fibroblaster, plasmid transfection tillämpades. Vi använde den primära fibroblast kultur som erhållits från HD patienter huden biopsi för denna studie.
Mutationen i HTT-proteingenen leder till förlängning av polyglutaminkanalen3. HTT har en roll i sådana cellulära processer som endocytos4,celltransport1,2,proteinnedbrytning5, etc. Väsentlig del av dessa processer involverar olika delar av cellen cytoskeleton, inklusive mikrotubulerna.
Mänskliga primärceller är den bästa modellen för att reproducera händelser som inträffar i patientceller så nära som möjligt. För att skapa sådana modeller måste man isolera celler från mänskligt biopsimaterial (t.ex. från kirurgiska prover). Den resulterande primära cellinjen är lämplig att studera patogenes med hjälp av olika genetiska, biokemiska, molekylära och cellbiologiska metoder. Mänskliga primära cellkulturer tjänar också som en föregångare för att skapa olika transdifferentierade och transgena kulturer6.
Men i motsats till odödliga cellkulturer är den betydande nackdelen med primärceller deras begränsade passagekapacitet. Därför rekommenderar vi att du använder celler i det tidiga passagestadiet (upp till 15). Äldre kulturer degenererar mycket snabbt och förlorar sina unika egenskaper. De nyligen erhållna primärcellerna bör därför hållas frysta för långtidslagring.
Primära cellkulturer är mottagliga för odlingsförhållanden. Därför kräver de ofta unika tillvägagångssätt och optimering av odlingsförhållanden. I synnerhet kräver den mänskliga hudens primära fibroblaster som används i våra experiment på substratet. Därför använde vi olika ytterligare beläggningar (t.ex. gelatin eller fibronectin) beroende på experimenttyp.
Cellens cytoskeleton bestämmer cellformen, rörligheten och rörelse. Dynamiken i cytoskeleton är avgörande för många intracellulära processer både i interfas och mitos. I synnerhet är cytoskeleton polymeriserad från tubulin, mycket dynamiska och polära strukturer, vilket möjliggör motorproteinmedierad riktad riktad intracellulär transport. Mikrotubulis ändar är i konstant omorganisering, deras monteringsfaser växlar med demonteringsfaserna, och detta beteende kallas "dynamisk instabilitet"7,8,9. Olika associerade proteiner skiftar jämvikten i polymerisationsreaktionen, vilket leder antingen till polymerbildningen eller proteinmonombildningen. Tillsatsen av tubulinunderenheter sker huvudsakligen vid plus-änden av mikrotubuli10. Den slutbindande (EB) proteinfamiljen består av tre medlemmar: EB1, EB2 och EB3. De fungerar som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) och reglerar de dynamiska egenskaperna hos mikrotubuli genom att binda och stabilisera deras växande plus-ändar11.
Många studier använder fluorescerande molekylmärkt tubulin mikroinjektion eller transfektion med timelapse imaging och videoanalys för att visualisera mikrotubuli in vitro. Dessa metoder kan vara invasiva och skadliga för celler, särskilt primära mänskliga celler. Det mest utmanande steget är att hitta förutsättningar för celltransfektion. Vi försökte nå högsta möjliga nivå av transfektion utan att påverka livskraft och inhemska cellmorfologi. Denna studie tillämpar den klassiska metoden för att studera skillnaderna i mikrotubuledynamik i hudfibblaster hos friska donatorer och patienter med Huntingtons sjukdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Transfektion med ett fluorescerande märkt markörprotein av intresse i kombination med timelapse videomikroskopi är en klassisk metod för att studera cytoskelettets dynamiska egenskaper. Detta protokoll erbjuder en teknik för mänskliga primära fibroblast transfection, som kan vara svårt på grund av detaljerna i primära cell odling villkor. Dessutom kräver cytoskeleton dynamiskt fastighetsunderhåll en låg nivå av transfektion för att få ett bra signal-till-brus-förhållande utan att orsaka mikrotubulestabilisering. Det är viktigt att vidta åtgärder för att skydda cellerna från ljusinducerad stress och fluorescerande färgtoning. Under vårt arbete testade vi olika transfekteringsmetoder och protokoll samt olika vektorer för att välja den bästa kombinationen av förhållanden som lämpar sig för mänskliga primära fibroblaststudier. Vi analyserade de resulterande timelapse-videorna och beräknade mikrotubuledynamiken med ImageJ. Dynamiken hos mikrotubules plus-ändar i de olika celldelarna är inte liknande, så vi delade analysen i undergrupper - centrosomeregionen, lamellen och svansen av fibroblaster. Detta protokoll kan särskilt användas för in vitro-analys av cytoskeletondynamik i patientprover, vilket möjliggör nästa steg mot att förstå dynamiken i de olika sjukdomsutvecklingarna.

De resulterande GFP-EB3-filmerna som produceras med protokollet (bild 1) illustrerar mikrotubulis dynamiska egenskaper. Mikrotubuli är involverade i olika cellprocesser, och deras dynamiska egenskaper påverkar olika livsegenskaper hos den primära mänskliga cellkulturen från patienternas biopsimaterial (figur 2).
Följande parametrar bestämmer den dynamiska instabiliteten hos mikrotubuli: tillväxttakten (polymerisation) och krym...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Detta protokoll är dedikerat till microtubule plus-end visualisering av EB3 proteintransfektion för att studera deras dynamiska egenskaper i primärcellskultur. Protokollet genomfördes på mänskliga primära huden fibroblaster som erhållits från Huntingtons sjukdom patienter.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualisering i Huntingtons sjukdom modell baserat på mänskliga primära hud fibroblaster

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Huntingtons sjukdom, HD, är en obotlig, neurodegenerativ patologi orsakad av en mutation i genkodning huntingtin protein. Huntingtin är främst förknippat med blåsor och mikrotubuli, och troligen involverad i mikrotubuleberoende transportprocesser. För att studera mutant huntingtins påverkan på dynamiken hos mikrotubuler använde vi in vivo-visualisering av EB3-protein, som reglerar de dynamiska egenskaperna hos mikrotubuli genom att böja och stabilisera de växande plus-ändarna.För att ladda fluorescerande märkt EB3 i mänskliga huden fibroblaster, applicerade vi plasmid transfection. Vi använde den primära fibroblast kultur att få från EB3 patientens huden biopsi för denna studie. Leverera biopsin till laboratoriet inom några timmar i DMEM medium, kompletterat med 15 mikrogram per milliliter penicillin och 50 enheter per milliliter streptomycin.Placera biopsivävnad i en sex centimeter Petriskål, tillsammans med en liten mängd medium. Skär biopsiprovet i bitar som är ca 0,5 till en millimeter stora med hjälp av en steril skalpell. Placera en, två, erhållna fragment i en 3,5 centimeter Petri-skål och placera ett sterilt lock över biopsibitarna.Tillsätt långsamt 1,5 milliliter av ett tillväxtmedium. Kulturfiberblaster i tillväxtmediet i en CO2-inkubator, i 5% CO2 som är sju Centigrade, 80% luftfuktighet. Efter fyra, sju dagar börjar först keratinocyter, sedan fibroblaster migrera från vävnaden till botten av skålen.Cellodling. För transfektvisualisering bör glaskonfokala tallriksrätter, konfokala rätter användas. Täck skålbotten med autoklaverad 0,1% gelatinlösning beredd i destillatvatten.Inkubera i 15 minuter. Förbered odlingsmediet. Blanda noggrant, förvara hög på plus 4 Centigrade.Värm mediet till plus 37 Centigrade innan du lägger till cellerna. Utvärdera kulturen under mikroskopet. Ta bort mediet och tvätta cellerna med en steril DPBS.Tillsätt en milliliter förvärmd 0,25% trypsinlösning till cellerna. Kontrollera cellerna under mikroskopet om de lossnar helt från substratet. Inaktivera trypsin med en milliliter av odlingsmediet.Överför cellfjädringen till ett koniskt rör på 15 milliliter. Centrifugera röret vid 200 G i fem minuter. Ta bort supernatanten, återanvänd cellpaletten i en milliliter av odlingsmediet.Räkna cellnumret. Beräkna önskat antal celler. Avfrö dem med en densitet på åtta till 15, multiplicerat med 10 till kraften av tre, passerade med en centimeter.Detta panoreras till milliliter av odlingsmediet. Ta bort gelatinlösningen från odlingsskålen som beretts för inokulering och tillsätt omedelbart två milliliter av cellupphängningen. Odla fibroblaster vid plus 37 Centigrade i en CO2-inkubator.Uppdatera mediet varannan, var fjärde dag. För experiment, använd cellerna i fyra, 11 passager. Vid tidpunkten för transfection bör sammanflödet inte vara mer än 70, 80%Ersätt odlingsmediet med ett nytt 24 timmar före transfektion.Förbered ett DNA-lipidkomplex, baserat på cellsåddens område och densitet. Liposomal transfection agent, och densiteten av cellsådden av en, multiplicerad med 10 till kraften av fyra celler, passerade med en centimeter användes. Tillsätt tre mikroliter kommersiellt reagens till 125 mikroliter Opti-MEM, som inte innehåller något antibiotikum.Utan att röra rörväggarna, återanvänd försiktigt. Späd ut plasmid-DNA, GFP-EB3, tillsätt ett mikrogram av plasmid-DNA till 125 mikroliter optimem. Försiktigt återanvända.Tillsätt utspädd plasmid-DNA till varje rör av utspädd transfekteringsreagens, ett till ett förhållande. Inkubera i 30 minuter. Tillsätt DNA-lipidkomplexet till den sex centimeter Petri skålen med celler.Blanda med en korsformad gunga i 30 sekunder. Inkubera celler med ett transfekteringsmedel i 24 timmar och byt sedan mediet till färskt. Analysera effektiviteten efter inspektion på 24 och 48 timmar.Förbereder för avbildning. Innan levande avbildning av celler, ändra odlingsmediet till ett medium utan PH-indikatorfärg för att minska autofluorescens. Applicera försiktigt mineralolja på medelcellsfasen för att helt täcka mediet, isolera det från den yttre miljön för att minska O2-penetrationen och den medelstora avdunstningen.Använd en makrolampa och all bild i 60-faldig, 100-faldig objektiv med hög siffra bländare för att ta bild. För in viva observationer måste mikroskopet vara utrustat med en inkubator för att upprätthålla de nödvändiga förutsättningarna för cellerna, inklusive att slå på det optiska bordet, och linsen för att passera 37 Centigrade, en sluten kammare var CO2-tillförsel och fuktighetsnivå stöd. Placera den konfokala skålen med cellerna i mikroskophållaren före avbildning.Se till att skålen och kameran är ordentligt fastsatta på hållaren för att undvika drifting när du tar bilder. Ställa in bildparametrarna. Välj låga exponeringsvärden, eftersom bilden inducerar cellskada, reagerar med syreutrymmen.För att studera dynamiken hos mikrotubuli i human hudfibblaster valde vi en exponering på 300 millisekunder. Fokusera på föremålet för intresse. För långvarig, tidsfördröjning, det automatiska fokusstabiliseringssystemet, är perfekt fokussystem nödvändigt, eftersom det kan finnas ett skifte längs den inställda axeln, och föremålet för intresse kommer därmed att vara ur fokus.Välj de optimala bildförhållandena, beroende på cellens ljuskänslighet, och hastigheten på överstrålningskromat. Eftersom mikrotubuli är mycket dynamiska strukturer kan det i sin tur väljas ganska kort tid och bildhastigheten måste vara tillräckligt hög. För att undersöka mikrotubuledynamiken i huden fibroblaster, använde vi en frekvens av en bildruta per sekund, i tre, fem minuter.När du väljer nästa objekt för att få bild, flytta dig bort från det redan avbildade området, eftersom det under påverkan av ljus finns en elapsable fotoblödning. Eftersom vi använde en relativt hög bildfrekvens stängdes inte slutaren mellan bilderna, och lampan var sen under hela bildperioden, vilket bleknar ökade. Välj de optimala videorna för att studera mikrotubuledynamiken visuellt, med hänsyn till kvaliteten på transfektionen, kvaliteten på mikrotubulernas bilder, optimalt signal-till-brus-förhållande och frånvaron av drifting av analyserade celler.Använd de valda videorna för att studera mikrotubulerna plus-ends dynamiken genom att trunkera dem i Fiji-programmet. Det mest kritiska steget i protokollet är transfektion, vilket säkerställer tillräckligt proteinuttryck. Bra signal-till-brus-förhållande, ingen fotobleaching av mikrotubuler och avsaknad av celldrifting är avgörande för avbildning.In vivo visualisering av microtubule dynamik ger viktig information om egenskaperna hos mutant huntingtin. Vårt protokoll kan tillämpas på studier av andra sjukdomar, vars patologi involverar dynamiska egenskaper hos cytoskeleton.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Den tredimensionella human hud Rekonstruera Modell: ett verktyg för att studera normal hud och melanom Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En Full Skin Defect modell för att utvärdera Vaskularisering av biomaterial<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En mänsklig 3D extracellulär matrix-Adipocyte kultur modell för att studera Matrix-cell metabola överhörning

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...