Name: microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Bu araştırma Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı tarafından finanse edildi, Hibe No. 075-15-2019-1669 (fibroblastların transfeksiyon), Rusya Bilim Vakfı tarafından hibe 19-15-00425 (fibroblast in vitroekimi ile ilgili diğer tüm çalışmalar). Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi Geliştirme programı PNR5.13 (görüntüleme ve analiz) tarafından kısmen desteklendi. Yazarlar, A. N. Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü'ndeki Nikon Mükemmeliyet Merkezi'nin desteğini kabul ediyor. Seslendirme konusundaki yardımları için Ekaterina Taran'a özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Bu protokol, Federal Tıbbi Biyolojik Ajansı Fiziksel-Kimyasal Tıp Federal Araştırma ve Klinik Merkezi'nin 08 Eylül 2015 tarihli yönergelerini takip eder.
NOT: Şekil 1 protokole genel bir bakış sağlar.
1. İnsan derisi fibroblastlarının birincil kültürünü elde etmek (Şekil2)
<ol><li>Biyopsiyi Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM) ortamında 50 μg/mL p...

<ol>
	<li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin-associated+Protein+1+(HAP1)+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin.">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+facilitates+dynein/dynactin-mediated+vesicle+transport.">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li><li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington's+disease+mutation.">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li><li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus.">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li><li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Huntington's+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription.">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li><li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+Huntington's+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li><li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella.">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li><li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo:+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific.">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li><li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules.">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li><li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau.">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li><li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates.">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li><li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+neuronal+development,+plasticity,+and+neurodegeneration.">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li><li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development.">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li><li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+MTs:+persistent+growth+in+the+cell+interior,+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary.">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy.">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media.">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li></ol>

Mikrotübüllerin dinamik analizi için daha kaliteli sonuçlar yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerden elde edilebilir. Canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için gerekli tüm koşulları gözlemlemek ve görüntüleme parametrelerini doğru ayarlamak önemlidir. Cam tabanlı özel hücre kültürü yemekleri (konfokal yemekler) kullanmak önemlidir, çünkü cam plastikten farklı bir kırılma indeksine sahiptir. Camın kalınlığı ve tüm alanı üzerindeki homojenliği de son derece öneml...

Huntington hastalığı (HD), mutasyonin gen kodlamasıhuntingtin proteini (HTT) nedeniyle tedavi edilemez bir nörodejeneratif patolojidir. HTT öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübül bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır1,2. Mutant HTT'nin mikrotübül dinamikleri üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vitro görselleştirmesini kullandık. Floresan etiketli EB3'ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uygulandı. Bu çalışma için HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen primer fibroblast kültürünü kullandık.
HTT protein geninde mutasyon poliglutamin sisteminin uzaması3. HTT, endositoz4,hücre taşıma1,2,protein bozulması5,vb. Bu süreçlerin önemli bir kısmı, mikrotübüller de dahil olmak üzere hücre sitoskeletonunun çeşitli unsurlarını içerir.
İnsan birincil hücreleri, hasta hücrelerinde meydana gelen olayları mümkün olduğunca yakından yeniden üretmek için en iyi modeldir. Bu tür modeller oluşturmak için, hücreleri insan biyopsi malzemesinden (örneğin cerrahi örneklerden) izole etmek gerekir. Ortaya çıkan primer hücre hattı, çeşitli genetik, biyokimyasal, moleküler ve hücre biyolojisi yöntemlerini kullanarak patogenez çalışmak için uygundur. Ayrıca, insan birincil hücre kültürleri çeşitli transdifferentiated ve transgenik kültürler oluşturmak için bir öncü olarak hizmet vermektedir6.
Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinin aksine, birincil hücrelerin önemli dezavantajı sınırlı geçiş kapasiteleridir. Bu nedenle, hücreleri erken geçiş aşamasında (15'e kadar) kullanmanızı öneririz. Eski kültürler çok hızlı bir şekilde dejenere lanır ve benzersiz özelliklerini kaybeder. Bu nedenle, yeni elde edilen birincil hücreler uzun süreli depolama için dondurulmalıdır.
Birincil hücre kültürleri yetiştirme koşullarına karşı hassastır. Bu nedenle, genellikle benzersiz yaklaşımlar ve büyüme koşullarının optimizasyonu gerektirirler. Özellikle, deneylerimizde kullanılan insan derisi birincil fibroblastları substrat üzerinde talep ediyor. Bu nedenle, deney türüne bağlı olarak çeşitli ek kaplamalar (örneğin jelatin veya fibronektin) kullandık.
Hücre sitoskeleton hücre şeklini, hareketliliğini ve hareketliliğini belirler. Sitoskeletonun dinamikleri hem interfaz hem de mitozda birçok hücre içi süreç için çok önemlidir. Özellikle, tübulinden polimerize edilen sitoskeleton, motor protein aracılı hücre içi taşımayı sağlayan son derece dinamik ve polar yapılardır. Mikrotübüllerin uçları sürekli yeniden düzenlenir, montaj aşamaları sökme aşamalarıyla değişir ve bu davranışa "dinamik kararsızlık"7,8,9denir. Çeşitli ilişkili proteinler polimerizasyon reaksiyonunun dengesini değiştirerek polimer oluşumuna veya protein monomer oluşumuna yol açtı. Tübulin alt ünüllerinin eklenmesi esas olarak mikrotübüllerin artı ucunda meydana gelir10. Son bağlayıcı (EB) protein ailesi üç üyeden oluşur: EB1, EB2 ve EB3. Artı uç izleme proteinleri (+TIP' ler) görevi gösterirler ve büyüyen artı uçlarını bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerinidüzenlerler 11.
Birçok çalışma, mikrotübülleri in vitroolarak görselleştirmek için zaman atlamalı görüntüleme ve video analizi ile floresan molekül etiketli tübulin mikroenjeksiyonu veya transfeksiyonu kullanır. Bu yöntemler istilacı ve hücrelere, özellikle birincil insan hücrelerine zararlı olabilir. En zorlu adım hücre transfeksiyon için koşulları bulmaktır. Canlılığı ve doğal hücre morfolojisini etkilemeden mümkün olan en yüksek transfeksiyon seviyesine ulaşmaya çalıştık. Bu çalışma, sağlıklı donörlerin ve Huntington hastalığı olan hastaların cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerindeki farklılıkları incelemek için klasik yöntemi uygular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera iXon DU897 EMCCD</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set HYQ FITC</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA-II Automated Cell Counte</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope incubator for lifetime filming</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gas controller CO2-O2-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica, Olympus, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil (Light white oil)</td>
			<td>MP</td>
			<td>151694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>20035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Dish (glass thickness 170 &#181;m)</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>211350</td>
			<td>Alternative: MatTek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>SPL Lifesciences</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate-salt solution)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>K053/SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (bovine skin)</td>
			<td>PanEko</td>
			<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg" />070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>519850026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>PanEko</td>
			<td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA with EB3-GFP</td>
			<td>Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova 
			[Erasmus University, Rotterdam]</td>
			<td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model based on human primary skin fibroblasts

Zaman atlamalı video mikroskopisi ile birlikte ilgi çekici floresan etiketli bir işaret proteini ile transfection, sitoskeletonun dinamik özelliklerini incelemek için klasik bir yöntemdir. Bu protokol, birincil hücre ekim koşullarının özellikleri nedeniyle zor olabilen insan primer fibroblast transfeksiyonu için bir teknik sunmaktadır. Ek olarak, sitoskeleton dinamik özellik bakımı, mikrotübül stabilizasyonuna neden olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için düşük düzeyde transfeksiyon gerektirir. Hücreleri ışık kaynaklı stresten ve floresan boya solmasından korumak için önlemler almak önemlidir. Çalışmalarımız boyunca, insan birincil fibroblast çalışmalarına uygun koşulların en iyi kombinasyonunu seçmek için farklı transfeksiyon yöntemlerini ve protokollerini ve farklı vektörleri test ettik. Ortaya çıkan hızlandırılmış videoları analiz ettik ve ImageJ kullanarak mikrotübül dinamiklerini hesapladık. Mikrotübüllerin farklı hücre parçalarındaki artı uçlarının dinamikleri benzer değildir, bu nedenle analizi alt gruplara ayırdık - merkezkant bölge, lamel ve fibroblastların kuyruğu. Özellikle, bu protokol hasta örneklerinde sitoskeleton dinamiklerinin in vitro analizi için kullanılabilir ve çeşitli hastalık gelişiminin dinamiklerini anlamaya yönelik bir sonraki adımı sağlar.

Protokol kullanılarak üretilen GFP-EB3 filmleri (Şekil 1) mikrotübüllerin dinamik özelliklerini göstermektedir. Mikrotübüller farklı hücre süreçlerine dahil olur ve dinamik özellikleri hastaların biyopsi materyalinden birincil insan hücre kültürünün çeşitli yaşam özelliklerini etkiler (Şekil 2).
Aşağıdaki parametreler mikrotübüllerin dinamik kararsızlığını belirler: büyüme (polimerizasyon) ve küç...

Watch this Scientific Journal Video about Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts at JoVE.com

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Huntington hastalığı, HD, gen kodlama huntingtin proteininde bir mutasyonun neden olduğu tedavi edilemez, nörodejeneratif bir patolojidir. Huntingtin öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübüle bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır. Mutant huntingtin'in mikrotübüllerin dinamizmi üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bükerek ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vivo görselleştirmesini kullandık.Floresan etiketli EB3'ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uyguladık. Bu çalışma için EB3 hastasının cilt biyopsisinden elde etmek için primer fibroblast kültürünü kullandık. Biyopsiyi mililitre penisilin başına 15 mikrogram ve mililitre streptomisinin mililitresi ile desteklenmiş DMEM ortamında birkaç saat içinde laboratuvara teslim edin.Biyopsi dokusunu az miktarda ortamla birlikte altı santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir neşter kullanarak biyopsi örneğini yaklaşık 0,5 ila bir milimetre büyüklüğünde parçalara ayırın. Bir, iki, elde edilen parçaları 3,5 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve biyopsi parçalarının üzerine steril bir kapak kayması yerleştirin.Yavaşça bir büyüme ortamının 1,5 mililitresini ekleyin. Bir CO2 inkübatöründe büyüme ortamında kültür fiberblastları, yedi Santigrat,% 80 nem olan% 5 CO2'de. Dört, yedi gün sonra, önce keratinositler, daha sonra fibroblastlar dokudan yemeğin dibine göç etmeye başlar.Hücre ekimi. Transfeksiyon görselleştirme için cam konfokal tabak yemekleri, konfokal yemekler kullanılmalıdır. Tabak tabanını damıtılmış suda hazırlanan otomatik kapatılmış%0,1 jelatin çözeltisi ile örtün.15 dakika kuluçkaya yatır. Kültür ortamını hazırlayın. İyice karıştırın, artı 4 Santigrat'ta uzun süre saklayın.Hücrelere eklemeden önce orta ila artı 37 Santigrat ısıtın. Kültürü mikroskop altında değerlendirin. Ortamı çıkarın ve hücreleri steril bir DPBS ile yıkayın.Hücrelere bir mililitre önceden ısıtılmış %0,25 tripsin çözeltisi ekleyin. Mikroskop altındaki hücreleri, alt tabakadan tamamen ayrılırlarsa kontrol edin. Tripini kültür ortamının bir mililitresiyle devre dışı bırak.Hücre süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Üstnatant kaldırın, hücre paletini kültür ortamının bir mililitresinde yeniden diriltin.Cep telefonu numarasını say. Gerekli hücre sayısını hesaplayın. Sekiz ila 15 yoğunluklu, 10 ile üç gücüyle çarpılmış, bir santimetre ile geçirilen tohumlarını çözün.Bu, kültür ortamının mililitrelerine dönüştürülür. Jelatin çözeltisini aşılama için hazırlanan kültür çanaktan çıkarın ve hemen iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Co2 inkübatörde artı 37 Santigrat'ta fibroblast yetiştirin.Ortamı her iki, dört günde bir yenileyin. Deneyler için dört, 11 pasajlık hücreleri kullanın. Transfeksiyon sırasında, izdiham en fazla 70, % 80 olmalıdır Transfection'dan 24 saat önce kültür ortamını taze bir ortamla değiştirin.Hücre tohumlama alanına ve yoğunluğuna göre bir DNA-lipid kompleksi hazırlayın. Lipozomal transfeksiyon ajanı ve bir santimetre ile geçirilen dört hücrenin gücüne 10 ile çarpılan bir hücre tohumlama yoğunluğu kullanıldı. 125 mikrolitre Opti-MEM'e antibiyotik içermeyen üç mikrolitre ticari reaktif ekleyin.Tüp duvarlarına dokunmadan, yavaşça yeniden diriltin. Plazmid DNA'sını seyreltin, GFP-EB3, 125 mikrolitre OptiMEM'e plazmid DNA'sının bir mikrogramını ekleyerek. Yavaşça yeniden dirilt.Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin her tüpüne bire bir oran olmak üzere seyreltilmiş plazmid DNA ekleyin. 30 dakika kuluçkaya yatır. DNA lipid kompleksini hücrelerle altı santimetre petri kabına ekleyin.30 saniye boyunca bir haç teli ile karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca bir transfeksiyon ajanı ile kuluçkaya yatırın, ardından ortamı taze olana değiştirin. 24 ve 48 saat içinde muayeneden sonra verimliliği analiz edin.Görüntülemeye hazırlanıyoruz. Hücrelerin canlı görüntülenmesinden önce, otofluoresansı azaltmak için kültür ortamını PH gösterge boyası olmayan bir ortama değiştirin. Orta hücre fazını tamamen örtmek için mineral yağı dikkatlice uygulayın, O2 penetrasyonunu ve orta buharlaşmayı azaltmak için dış ortamdan izole edin.Görüntü almak için yüksek rakamlı diyaframa sahip 60 kat, 100 kat objektif lenste bir makro lamba ve tüm görüntü kullanın. Viva gözlemlerinde, mikroskop, optik masaya vurmak da dahil olmak üzere hücreler için gerekli koşulları korumak için bir inkübatör ve lensin 37 Santigrat'ı geçmesi için bir inkübatör ile donatılmalıdır, kapalı bir oda CO2 kaynağıydı ve nem seviyesi destek. Konfokal kabı görüntülemeden önce mikroskop tutucusuna hücrelerle birlikte yerleştirin.Görüntü çekerken sürüklenmeyi önlemek için çanağın ve kameranın tutucuya güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Görüntüleme parametreleri ayarlıyor. Slayt hücreye zarar verdiğinden, oksijen boşluklarıyla reaksiyona neden olduğundan, düşük pozlama değerlerini seçin.İnsan derisi fibroblastlarındaki mikrotübüllerin dinamiklerini incelemek için 300 milisaniyelik bir maruziyet seçtik. İlgi çekici nesneye odaklanın. Uzun süreli, hızlandırılmış görüntüleme için otomatik odak sabitleme sistemi, mükemmel odak sistemi gereklidir, çünkü ayarlanan eksen boyunca bir kayma olabilir ve ilgi çekici nesne böylece odak dışında kalacaktır.Hücrenin ışığa duyarlılığına ve parlama krom solma hızına bağlı olarak en uygun görüntüleme koşullarını seçin. Mikrotübüller son derece dinamik yapılar olduğundan, makul derecede kısa bir süre seçilebilir ve kare hızı yeterince yüksek olmalıdır. Cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerini araştırmak için üç, beş dakika boyunca saniyede bir kare frekans kullandık.Görüntü almak için bir sonraki nesneyi seçerken, zaten görüntülenmiş alandan uzaklaşın, çünkü ışığın etkisi altında, geçilebilir bir fotoğraf kanaması vardır. Nispeten yüksek bir görüntüleme frekansı kullandığımız için, deklanşör görüntüler arasında kapanmadı ve lamba tüm görüntüleme süresi boyunca geç kaldı, bu da soluyor. Transeksiyon kalitesini, mikrotübüllerin görüntülerinin kalitesini, optimum sinyal-gürültü oranını ve analiz edilen hücrenin sürüklenmesinin yokluğunu göz önünde bulundurarak mikrotübül dinamiklerini görsel olarak incelemek için en uygun videoları seçin.Seçilen videoları, Fiji programında yerle bir ederek mikrotübülleri artı uçlu dinamikleri incelemek için kullanın. Protokoldeki en kritik adım transfeksiyondur ve yeterli protein ekspresyonunu sağlar. İyi sinyal-gürültü oranı, mikrotübüllerin fotobleaching olmaması ve hücre sürüklenmesinin olmaması görüntüleme için kritik öneme sahiptir.Mikrotübül dinamiklerinin in vivo görselleştirilmesi, mutant huntingtin özellikleri hakkında hayati bilgiler sağlar. Protokolümüz, patolojisi sitoskeletonun dinamik özelliklerini ima eden diğer hastalıkların çalışmalarına uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...