Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
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图形是使用BioRender创建的。该研究由Inserm，巴黎大学，地平线2020（PREMSTEM-874721），法国基金会，ARSEP基金会，切尔沃研究基金会，摩纳哥格雷斯基金会资助，以及未来投资-ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS和Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.的额外资助。

该协议获得批准，所有动物均根据国家卫生和科学研究研究所（法国Inserm）的机构准则进行处理。介绍了 P8 处 24 只 OF1 小鼠幼崽（雄性和雌性）大脑中小胶质细胞的磁分离，分为 6 孔、12 孔或 96 孔板。实验工作在引擎盖下进行，以保持无菌条件。
1. 制备用于分离和细胞培养的无菌溶液
<ol><li>从市售的 10x 溶液中制备 50 mL 不含 Ca 2+ 和 Mg2+ （HBSS<s...

目前的工作展示了使用磁分选CD11b +细胞的原代小胶质细胞培养物。除了小胶质细胞功能评估（RT-qPCR和吞噬细胞测定）外，还测定了小胶质细胞培养纯度。
经典的小胶质细胞培养物通常由 P1 或 P2 啮齿动物新生儿脑生成，并与星形胶质细胞共培养至少 10 天。然后使用轨道摇床机械分离小胶质细胞。体 外分离 和培养小胶质细胞的方法在1990年代末首次从新生大鼠的大脑<su...

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞样细胞，来源于卵黄囊的红细胞生成前体，在胚胎早期发育期间迁移到神经上皮1。除了免疫功能外，它们在神经发育过程中也起着重要作用，特别是在突触发生、神经元稳态和髓鞘形成方面2。在成年期，小胶质细胞发展出长细胞过程以连续扫描环境。在脑损伤或脑部疾病等稳态破裂的情况下，小胶质细胞可以改变其形态外观，采用变形虫形状，迁移到受伤区域，增加和释放许多细胞保护或细胞毒性因子。小胶质细胞具有异质性激活状态，具体取决于其发育阶段和所受损伤的类型3，4，5。在这项研究中，这些激活状态大致分为三种不同的表型：促炎/吞噬细胞，抗炎和免疫调节，请记住，实际上，情况可能更复杂6。
由于（1）断奶前动物的脆弱性和（2）小胶质细胞细胞数量少，在大脑发育的早期阶段研究体内小胶质细胞活化和神经保护策略的筛选可能具有挑战性。因此，小胶质细胞的体外研究广泛用于毒性7，8，9，神经保护策略5，10，11，12，13，14和共培养15，16，17，18，19，20，21.体外研究可以使用小胶质细胞系、干细胞来源的小胶质细胞或原代小胶质细胞培养。所有这些方法都有优点和缺点，选择取决于最初的生物学问题。使用原代小胶质细胞培养物的好处是同质的遗传背景、无病原体的历史以及控制动物死亡后小胶质细胞被刺激的时间22。
多年来，开发了不同的方法（流式细胞术，摇动或磁性标记）用于培养啮齿动物的初级小胶质细胞，包括新生儿和成人23，24，25，26，27，28，29。在本工作中，使用先前描述的磁激活细胞分选技术使用微珠包被的抗小鼠CD11b 25，27，29进行小鼠新生幼崽的小胶质细胞分离。CD11b是一种在骨髓细胞（包括小胶质细胞）表面表达的整合素受体。当大脑内没有炎症挑战时，几乎所有的CD11b +细胞都是小胶质细胞30。与先前发表的其他方法23，24，25，26，27，28，29相比，本协议平衡了即时离体小胶质细胞活化分析和常见的体外原代小胶质细胞培养。 因此，小胶质细胞（1）在出生后第（P）8天分离，没有髓磷脂去除，（2）无血清培养，（3）在脑分离后仅48小时暴露于siRNA，miRNA，药理化合物和/或炎症刺激。这三个方面中的每一个都使当前的协议具有相关性和快速性。首先，使用小儿小胶质细胞可以在培养中获得动态和反应性活细胞，而无需额外的脱髓鞘步骤，这可能会在体外改变小胶质细胞的反应性。本协议旨在尽可能接近小胶质细胞的生理环境。事实上，小胶质细胞从未遇到过血清，并且该方案也不需要使用血清。此外，早在培养后48小时暴露小胶质细胞可以防止它们失去生理能力。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

小胶质细胞作为大脑驻留巨噬细胞，是多种功能的基础，包括对环境压力的反应和大脑稳态。小胶质细胞可以采用大谱活化表型。此外，支持促炎表型的小胶质细胞与神经发育和神经退行性疾病有关。 体外 研究广泛用于评估特定细胞类型的潜在治疗策略的研究。在这种情况下，使用原代小胶质细胞培养物在 体外研究 小胶质细胞活化和神经炎症比小胶质细胞系或干细胞衍生的小胶质细胞更相关。然而，某些原代培养物的使用可能会受到缺乏可重复性的影响。该协议提出了一种从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞的可重复和相关方法。这里展示了在4小时和24小时后通过mRNA表达定量和Cy3-珠吞噬细胞测定使用几种刺激物的小胶质细胞活化。目前的工作有望提供一种易于复制的技术，用于从青少年发育阶段分离生理相关的小胶质细胞。

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞，当暴露于环境挑战（创伤，有毒分子，炎症）时被激活4，5，6，34（图3A）。小胶质细胞的体外研究通常用于评估与这些环境挑战相关的细胞自主机制，并表征药理学或遗传操作后的激活状态。本文提出了一种使用磁耦合珠在幼...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

原代小胶质细胞培养通常用于评估新的抗炎分子。本协议描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞。

从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

该协议使我们能够在与体内特征非常相似的条件下培养小胶质细胞。使用磁性细胞分选技术，我们的方案允许我们在体外仅两天刺激小胶质细胞，而无需在培养基中使用任何血清。首先，用小剪刀从颈部到鼻子剪开皮肤，沿着 15 到 20 毫米的矢状缝合线。插入尖端，大孔与颅骨平行。从两侧切到眼睛。用小剪刀剪开眼睛之间，将头骨和大脑与头部分离。用两个镊子抓住靠近嗅球的头骨，然后小心地撕裂头骨。用剃须刀片去除小脑和嗅觉球，将大脑切成两块。将脑碎片放入含有40毫升不含钙和镁的HBSS的培养皿中。根据此表制备解离混合物。将 12 个脑碎片转移到 C 管中，每个解离管的总重量为 1.2 克。然后将C管放在解离器上加热。在解离器中启动优化的NTDK程序。离心20秒。通过移液三次完成机械解离。将细胞转移到四个带有过滤器的15毫升管中。用10毫升含有钙和镁的HBSS冲洗过滤器。离心10分钟，用10毫升移液管除去上清液。小心地加入10毫升含有钙和镁的HBSS，然后重新悬浮沉淀。再次，离心并除去上清液。用六毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。重复离心并弃去上清液。然后加入 200 微升 CD11b 微珠溶液，并将试管在 4 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟。孵育后，用六毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。重复离心并用八毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。接下来，按照分离器上的波塞尔程序准备八列。通过一次添加一毫升细胞悬液使细胞通过色谱柱。用一毫升分选缓冲液，在无菌洗脱板上洗脱CD11b阳性细胞。将细胞汇集在50毫升管中。离心并用10毫升冷小胶质细胞培养基重新悬浮沉淀。计数CD11b阳性细胞。将细胞重新悬浮在冷小胶质细胞培养基中，以获得每毫升650，000至700，000个细胞的最终浓度。将悬浮液分配到细胞培养板中。将板在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育过夜。第二天，用预热的小胶质细胞培养基替换培养基，并重复孵育过夜。在此步骤之前刺激细胞，并在刺激的最后三个小时内进行吞噬测定。根据此表以每个细胞50个珠子的比例计算磁珠数量。准备珠子混合物。将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育一小时。每10分钟涡旋一次。向每个孔中加入计算出的珠状溶液体积并孵育三小时。使用这种方法，在通过促炎因子（例如白细胞介素-1 β）加干扰素 γ 或脂多糖刺激后评估小胶质细胞的吞噬活性。刺激6至24小时后，用共聚焦显微镜分析荧光Cy3小胶质细胞珠。6小时后，小胶质细胞仅在白细胞介素-1 β加干扰素γ条件下开始吞噬Cy3磁珠。24小时后，两种刺激的Cy3荧光都有所增加，突出了吞噬活性的增加。流式细胞术提高了小胶质细胞培养物的纯度，分选后细胞活力增加。使用流式细胞术和RT-qPCR细胞群标记物分析出生后第八天从小鼠大脑中分选CD11b阳性细胞之前和之后。这些分析区分了各种脑细胞群，例如用于小胶质细胞的CX3CR135，用于少突胶质细胞的O4或OLIG2，用于神经元的NeuN或突触素，以及用于星形胶质细胞的ACSA-2或GFAP。使用CD11b抗体进行细胞分选后，仅获得小胶质细胞。重要的是在将悬浮液添加到色谱柱时非常轻柔地移液，以防止堵塞并避免机械细胞死亡。在这种方法之后，可以进行转录组蛋白质组学，例如蛋白质血液或Luminex，甚至免疫化学，以查看小胶质细胞刺激的效果。

Research

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