Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Tallene er skabt ved hjælp af BioRender. Forskningen er finansieret af Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et yderligere tilskud fra Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Protokollen blev godkendt, og alle dyrene blev håndteret i henhold til de institutionelle retningslinjer fra Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrig). Magnetisk isolering af microglia fra hjernen hos 24 OF1 museunger (både mandlige og kvindelige) ved P8, opdelt i 6-brønd, 12-brønd eller 96-brøndplader, præsenteres. Det eksperimentelle arbejde blev udført under en hætte for at opretholde sterile forhold.
1. Fremstilling af sterile opløsnin...

Det nuværende arbejde præsenterer en primær mikroglialcellekultur ved hjælp af magnetisk sorterede CD11b + celler. Ud over den mikrogliale funktionelle evaluering (RT-qPCR og fagocytiske assays) blev mikroglialkulturens renhed også bestemt.
Klassiske microgliacellekulturer genereres almindeligvis fra P1- eller P2-gnavernyfødt hjerne og samkultur med astrocytter i mindst 10 dage. Microglia adskilles derefter mekanisk ved hjælp af en orbital shaker. Metoden til at isolere og dyrke microgl...

Microglia er centralnervesystemet bosiddende makrofaglignende celler afledt af erythropoietiske forstadier af æggeblommesækken, der migrerer til neuroepitelet under tidlig embryonal udvikling1. Bortset fra deres immunitetsfunktioner spiller de også en væsentlig rolle under neuroudvikling, især for synaptogenese, neuronal homeostase og myelinering2. I voksenalderen udvikler microglia lange cellulære processer til at scanne miljøet kontinuerligt. I tilfælde af homeostasebrud som hjerneskade eller hjernesygdom kan microglia ændre deres morfologiske udseende for at vedtage en amoeboid form, migrere til det skadede område, øge og frigive mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstande afhængigt af deres udviklingsstadium og typen af skade, der er pådraget 3,4,5. I denne undersøgelse er disse aktiveringstilstande bredt klassificeret i tre forskellige fænotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunoregulerende, idet man husker på, at situationen i virkeligheden sandsynligvis vil være mere kompleks6.
At studere in vivo mikroglial aktivering og screening for neurobeskyttende strategier i tidlige stadier af hjernens udvikling kan være udfordrende på grund af (1) skrøbelighed hos dyr før fravænning og (2) det lave antal mikroglialceller. Derfor anvendes in vitro-undersøgelser af microglia i vid udstrækning for toksicitet 7,8,9, neurobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og cokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-undersøgelser kan anvende enten mikroglialcellelinjer, stamcelleafledt microglia eller primær microglia-kultur. Alle disse tilgange har fordele og ulemper, og valget afhænger af det oprindelige biologiske spørgsmål. Fordelene ved at bruge primære microglia-kulturer er den homogene genetiske baggrund, patogenfri historie og kontrol af det tidspunkt, hvor microglia stimuleres efter dyredød22.
I årenes løb blev der udviklet forskellige metoder (flowcytometri, rystelser eller magnetisk mærkning) til dyrkning af primær mikroglia fra gnavere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbejde udføres mikroglia-isolering fra musenyfødte hvalpe ved hjælp af tidligere beskrevet magnetisk aktiveret cellesorteringsteknologi ved hjælp af mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreceptor udtrykt på overfladen af myeloide celler, herunder microglia. Når der ikke er nogen inflammatorisk udfordring i hjernen, er næsten alle CD11b + celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere offentliggjorte metoder 23,24,25,26,27,28,29 balancerer den nuværende protokol øjeblikkelige ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser og almindelig in vitro primær mikroglialkultur. Således isoleres microglia (1) ved postnatal dag (P)8 uden myelinfjernelse, (2) dyrkes uden serum og (3) udsættes enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og / eller inflammatoriske stimuli kun 48 timer efter hjerneisolering. Hvert af disse tre aspekter gør den nuværende protokol relevant og hurtig. Først og fremmest tillader brugen af pædiatrisk microglia at opnå dynamiske og reaktive levedygtige celler i kultur uden at kræve et yderligere demyeliniseringstrin, der potentielt kan ændre mikroglial reaktivitet in vitro. Den nuværende protokol sigter mod at komme så tæt som muligt på det fysiologiske miljø i microglia. Faktisk støder microglia aldrig på serum, og denne protokol kræver heller ikke brug af serum. Desuden forhindrer eksponering af microglia så tidligt som 48 timer efter kultur dem i at miste deres fysiologiske evner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Microglia, som hjerneboende makrofager, er grundlæggende for flere funktioner, herunder respons på miljøstress og hjernehomeostase. Microglia kan vedtage et stort spektrum af aktiveringsfænotyper. Desuden er microglia, der støtter proinflammatorisk fænotype, forbundet med både neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser. In vitro-undersøgelser anvendes i vid udstrækning i forskning til at evaluere potentielle terapeutiske strategier i specifikke celletyper. I denne sammenhæng er det mere relevant at studere mikroglial aktivering og neuroinflammation in vitro ved hjælp af primære mikroglialkulturer end mikroglialcellelinjer eller stamcelleafledt microglia. Imidlertid kan brugen af nogle primære kulturer lide af manglende reproducerbarhed. Denne protokol foreslår en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe. Mikroglial aktivering ved hjælp af flere stimuli efter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspressionskvantificering og et Cy3-perle fagocytisk assay er demonstreret her. Det nuværende arbejde forventes at give en let reproducerbar teknik til isolering af fysiologisk relevant mikroglia fra ungdomsudviklingsstadier.

Microglia er den CNS-residente makrofag, der aktiveres, når den udsættes for miljømæssige udfordringer (traumer, giftige molekyler, betændelse)4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-undersøgelser af microglia anvendes almindeligvis til at evaluere celleautonome mekanismer relateret til disse miljømæssige udfordringer og karakterisere aktiveringstilstand eft...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Primære microglia-kulturer bruges almindeligvis til at evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe.

Magnetisk isolering af mikroglialceller fra nyfødt mus til primære cellekulturer

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Denne protokol giver os mulighed for at dyrke microglia under forhold, der nøje efterligner in vivo-egenskaberne. Ved hjælp af magnetisk cellesorteringsteknologi giver vores protokol os mulighed for kun at stimulere microglia to dage in vitro uden at bruge noget serum i kulturmediet. Til at begynde med skal du bruge en lille saks til at skære huden fra halsen til næsen efter sagittal suturen på 15 til 20 millimeter.Indsæt spidserne med foramen magnum parallelt med kraniet. Skær fra hver side til øjnene. Klip mellem øjnene med en lille saks for at løsne kraniet og hjernen fra hovedet.Med to tang skal du gribe kraniet tæt på de olfaktoriske pærer og forsigtigt rive kraniet. Fjern lillehjernen og den olfaktive pære med et barberblad, og skær hjernen i to stykker. Læg hjernestykkerne i en petriskål indeholdende 40 ml HBSS uden calcium og magnesium.Forbered dissociationsblanding i henhold til denne tabel. Overfør 12 hjernestykker til et C-rør til en samlet vægt på 1,2 gram pr. Dissociationsrør. Placer derefter C-rør på dissociateren med opvarmning.Start det optimerede NTDK-program i dissociateren. Centrifuge i 20 sekunder. Fuldfør den mekaniske dissociation ved pipettering tre gange.Overfør cellerne til fire 15 milliliter rør med vedhæftede sil. Skyl sierne med 10 ml HBSS med calcium og magnesium. Centrifuge i 10 minutter, og fjern supernatanten med en 10 milliliter pipette.Tilsæt forsigtigt 10 ml HBSS med calcium og magnesium, og suspender pelleten igen. Centrifuge igen og fjern supernatanten. Suspender pelleten igen med seks milliliter sorteringsbuffer.Gentag centrifugeringen og kassér supernatanten. Tilsæt derefter 200 mikroliter CD11b mikroperleopløsning og inkuber rørene i 15 til 20 minutter ved fire grader Celsius. Efter inkubation suspenderes pelleten igen med seks milliliter sorteringsbuffer.Centrifugeringen gentages, og pelleten ophænges igen med otte milliliter sorteringsbuffer. Følg derefter Possel-programmet på separatoren for at forberede otte kolonner. Før cellerne gennem søjlen ved at tilføje en milliliter cellesuspension ad gangen.Med en milliliter sorteringsbuffer fortyndes CD11b-positive celler på en steril elueringsplade. Saml cellerne i et 50 milliliter rør. Centrifuge og genophæng pelleten med 10 ml koldt mikrogliamedium.Tæl de CD11b-positive celler. Suspender cellerne i koldt mikroglia-medium for at få en endelig koncentration på 650.000 til 700.000 celler pr. Milliliter. Dispenser suspensionen i cellekulturplader.Inkuber pladerne natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. På den næste dag skal du udskifte mediet med forvarmet microglia-medium og gentage inkubationen natten over. Stimulere cellerne før dette trin, og udfør fagocytisk assay i løbet af de sidste tre timer af stimuleringen.Beregn antallet af perler i henhold til denne tabel i et forhold på 50 perler pr. Celle. Forbered perleblandingen. Inkuber røret i en time i et vandbad ved 37 grader Celsius.Vortex hvert 10. minut. Til hver brønd tilsættes det beregnede volumen af perleopløsningen og inkuberes i tre timer. Ved anvendelse af denne tilgang blev den fagocytiske aktivitet af microglia evalueret efter stimulering af proinflammatoriske faktorer, såsom interleukin-1 beta plus interferon gamma eller lipopolysaccharider.Efter stimulering i seks til 24 timer blev fluorescerende Cy3 microglia perler analyseret med konfokal mikroskop. Efter seks timer begynder microglia kun at fagocyt Cy3 perler under interleukin-1 beta plus interferon gamma tilstand. Efter 24 timer var der en stigning i Cy3-fluorescens for begge former for stimulering, hvilket fremhævede øget fagocytisk aktivitet.Renheden af mikroglialkultur blev forhøjet af flowcytometri, hvilket viste en stigning i cellelevedygtighed efter sortering. Ved hjælp af flowcytometri og RT-qPCR-cellepopulationsmarkører blev analyseret før og efter sortering af CD11b-positive celler fra musehjerner på postnatal dag otte. Disse analyser skelnede mellem forskellige hjernecellepopulationer, såsom CX3CR135 for microglia, O4 eller OLIG2 for oligodendrocytter, NeuN eller synaptophysin for neuroner og ACSA-2 eller GFAP for astrocytter.Efter cellesortering ved hjælp af CD11b-antistof blev der kun opnået mikroglia. Det er vigtigt at pipettere meget forsigtigt, mens suspensionen tilsættes søjlen for at forhindre tilstopning og undgå mekanisk celledød. Efter denne metode kan transkriptomisk proteomik, såsom vestligt blod eller Luminex, og endda immunokemi udføres for at se effekten af mikroglial stimulering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering af Primary Murine Brain mikrovaskulære endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Hurtig og Raffineret CD11b Magnetisk Isolering af Primary Mikroglia med Enhanced Renhed og Alsidighed

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolation og kultur af embryonale mus neurale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur af neuroner isoleret fra embryonale mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolering af musens primære mikroglia ved magnetisk aktiveret cellesortering i dyremodeller af demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...