Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Les figurines ont été créées à l’aide de BioRender. La recherche est financée par l’Inserm, l’Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), la Fondation de France, la Fondation ARSEP, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation Grace de Monaco, et une subvention complémentaire d’Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS et Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Le protocole a été approuvé et tous les animaux ont été manipulés conformément aux directives institutionnelles de l’Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France). L’isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau de 24 bébés souris OF1 (mâles et femelles) à P8, divisés en plaques à 6 puits, 12 puits ou 96 puits, est présenté. Le travail expérimental a été effectué sous une hotte pour maintenir des conditions stériles.
...

Les travaux actuels présentent une culture cellulaire microgliale primaire utilisant des cellules CD11b+ triées magnétiquement. En plus de l’évaluation fonctionnelle microgliale (RT-qPCR et tests phagocytaires), la pureté de la culture microgliale a également été déterminée.
Les cultures classiques de cellules microgliales sont généralement générées à partir du cerveau du nouveau-né de rongeurs P1 ou P2 et co-culture avec des astrocytes pendant au moins 10 jours. Les microgl...

Les microglies sont les cellules macrophages résidentes du système nerveux central dérivées des précurseurs érythropoïétiques du sac vitellin qui migrent vers le neuroépithélium au cours du développement embryonnaire précoce1. Outre leurs fonctions immunitaires, ils jouent également un rôle important au cours du développement neurologique, en particulier pour la synaptogenèse, l’homéostasie neuronale et la myélinisation2. À l’âge adulte, les microglies développent de longs processus cellulaires pour scanner l’environnement en continu. En cas de ruptures d’homéostasie telles qu’une lésion cérébrale ou une maladie cérébrale, les microglies peuvent modifier leur aspect morphologique pour adopter une forme amiboïde, migrer vers la zone lésée, augmenter et libérer de nombreux facteurs cytoprotecteurs ou cytotoxiques. Les microglies ont des états d’activation hétérogènes en fonction de leur stade de développement et du type de lésion subie 3,4,5. Dans cette étude, ces états d’activation sont largement classés en trois phénotypes différents : pro-inflammatoire/phagocytaire, anti-inflammatoire et immuno-régulateur, en gardant à l’esprit qu’en réalité, la situation est susceptible d’être plus complexe6.
L’étude in vivo de l’activation microgliale et le dépistage des stratégies neuroprotectrices aux premiers stades du développement du cerveau peuvent être difficiles en raison (1) de la fragilité des animaux avant le sevrage et (2) du faible nombre de cellules microgliales. Par conséquent, les études in vitro sur la microglie sont largement utilisées pour la toxicité 7,8,9, les stratégies neuroprotectrices 5,10,11,12,13,14 et les co-cultures 15,16,17,18,19,20,21 . Les études in vitro peuvent utiliser soit des lignées cellulaires microgliales, soit des microglies dérivées de cellules souches, soit une culture microgliale primaire. Toutes ces approches ont des avantages et des inconvénients, et le choix dépend de la question biologique initiale. Les avantages de l’utilisation de cultures microgliales primaires sont le fond génétique homogène, l’histoire exempte d’agents pathogènes et le contrôle du moment où les microglies sont stimulées après la mort de l’animal22.
Au fil des ans, différentes méthodes (cytométrie en flux, agitation ou marquage magnétique) ont été développées pour cultiver la microglie primaire de rongeurs, nouveau-nés et adultes 23,24,25,26,27,28,29. Dans le présent travail, l’isolement de la microglie à partir de bébés nouveau-nés de souris est effectué à l’aide de la technologie de tri cellulaire activée magnétique décrite précédemment à l’aide de CD11b25,27,29 anti-souris enrobé de microbilles. CD11b est un récepteur intégrine exprimé à la surface des cellules myéloïdes, y compris la microglie. Lorsqu’il n’y a pas de défi inflammatoire dans le cerveau, presque toutes les cellules CD11b+ sont des cellules microgliales30. Par rapport à d’autres méthodes publiées précédemment 23,24,25,26,27,28,29, le présent protocole équilibre les analyses d’activation microgliale ex vivo immédiates et la culture microgliale primaire in vitro commune. Ainsi, les microglies sont (1) isolées au jour postnatal (P)8 sans élimination de la myéline, (2) cultivées sans sérum, et (3) exposées soit à des siRNA, des miARN, des composés pharmacologiques et/ou des stimuli inflammatoires seulement 48 h après l’isolement cérébral. Chacun de ces trois aspects rend le protocole actuel pertinent et rapide. Tout d’abord, l’utilisation de la microglie pédiatrique permet d’obtenir des cellules viables dynamiques et réactives en culture sans nécessiter une étape de démyélinisation supplémentaire qui pourrait potentiellement modifier la réactivité microgliale in vitro. Le présent protocole vise à se rapprocher le plus possible de l’environnement physiologique de la microglie. En effet, les microglies ne rencontrent jamais de sérum, et ce protocole ne nécessite pas non plus l’utilisation de sérum. De plus, exposer les microglies dès 48 h après la culture les empêche de perdre leurs facultés physiologiques.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

La microglie, en tant que macrophages résidant dans le cerveau, est fondamentale pour plusieurs fonctions, y compris la réponse au stress environnemental et l’homéostasie cérébrale. La microglie peut adopter un large spectre de phénotypes d’activation. De plus, les microglies qui endossent le phénotype pro-inflammatoire sont associées à la fois à des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Les études in vitro sont largement utilisées dans la recherche pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles dans des types cellulaires spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de l’activation microgliale et de la neuroinflammation in vitro à l’aide de cultures microgliales primaires est plus pertinente que les lignées cellulaires microgliales ou la microglie dérivée de cellules souches. Cependant, l’utilisation de certaines cultures primaires pourrait souffrir d’un manque de reproductibilité. Ce protocole propose une méthode reproductible et pertinente d’isolement magnétique de la microglie des nouveau-nés. L’activation microgliale utilisant plusieurs stimuli après 4 h et 24 h par quantification de l’expression de l’ARNm et un dosage phagocytaire à billes de Cy3 est démontrée ici. Les travaux actuels devraient fournir une technique facilement reproductible pour isoler les microglies physiologiquement pertinentes des stades de développement juvéniles.

La microglie est le macrophage résident du SNC qui s’active lorsqu’il est exposé à des défis environnementaux (traumatisme, molécules toxiques, inflammation)4,5,6,34 (Figure 3A). Les études in vitro sur la microglie sont couramment utilisées pour évaluer les mécanismes autonomes cellulaires liés à ces défis environnementaux et caractériser...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Ce protocole nous permet de cultiver la microglie dans des conditions qui imitent étroitement les caractéristiques in vivo. En utilisant la technologie de tri cellulaire magnétique, notre protocole nous permet de stimuler la microglie seulement deux jours in vitro, sans utiliser de sérum dans le milieu de culture. Pour commencer, utilisez de petits ciseaux pour couper la peau du cou au nez, en suivant la suture sagittale de 15 à 20 millimètres.Insérez les pointes avec le foramen magnum parallèle au crâne. Couper de chaque côté aux yeux. Coupez entre les yeux avec de petits ciseaux pour détacher le crâne et le cerveau de la tête.Avec deux pinces, saisissez le crâne près des bulbes olfactifs et déchirez soigneusement le crâne. Avec une lame de rasoir, retirez le cervelet et le bulbe olfactif et coupez le cerveau en deux morceaux. Placez les morceaux de cerveau dans une boîte de Petri contenant 40 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium.Préparer le mélange de dissociation selon ce tableau. Transférer 12 morceaux de cerveau dans un tube C pour un poids total de 1,2 gramme par tube de dissociation. Placez ensuite les tubes C sur le dissociateur avec chauffage.Démarrez le programme NTDK optimisé dans le dissociateur. Centrifuger pendant 20 secondes. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois.Transférer les cellules dans quatre tubes de 15 millilitres munis de crépines. Rincez les passoires avec 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium. Centrifuger pendant 10 minutes et retirer le surnageant avec une pipette de 10 millilitres.Ajoutez soigneusement 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium et remettez la pastille en suspension. Encore une fois, centrifuger et retirer le surnageant. Re-suspendre la pastille avec six millilitres de tampon de tri.Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution de microbilles CD11b et incuber les tubes pendant 15 à 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, remettre en suspension la pastille avec six millilitres de tampon de tri.Répétez la centrifugation et remettez la pastille en suspension avec huit millilitres de tampon de tri. Ensuite, suivez le programme Possel sur le séparateur pour préparer huit colonnes. Passez les cellules à travers la colonne en ajoutant un millilitre de suspension cellulaire à la fois.Avec un millilitre de tampon de tri, éluer les cellules CD11b positives sur une plaque d’élution stérile. Regroupez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger et remettre en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu microglial froid.Comptez les cellules CD11b positives. Re-suspendre les cellules dans un milieu microglial froid pour obtenir une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules par millilitre. Distribuer la suspension dans des plaques de culture cellulaire.Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu microglial préchauffé et répétez l’incubation pendant la nuit. Stimuler les cellules avant cette étape et effectuer un dosage phagocytaire pendant les trois dernières heures de la stimulation.Calculez le nombre de perles selon ce tableau à un ratio de 50 perles par cellule. Préparez le mélange de perles. Incuber le tube pendant une heure au bain-marie à 37 degrés Celsius.Vortex toutes les 10 minutes. À chaque puits, ajoutez le volume calculé de la solution de billes et incuber pendant trois heures. En utilisant cette approche, l’activité phagocytaire de la microglie a été évaluée après stimulation par des facteurs pro-inflammatoires, tels que l’interleukine-1 bêta, plus l’interféron gamma, ou les lipopolysaccharides.Après une stimulation de six à 24 heures, les billes fluorescentes de microglie Cy3 ont été analysées au microscope confocal. Après six heures, la microglie commence à phagocyter les billes Cy3 uniquement dans des conditions d’interleukine-1 bêta plus interféron gamma. Après 24 heures, il y avait une augmentation de la fluorescence Cy3 pour les deux types de stimulation, soulignant une activité phagocytaire accrue.La pureté de la culture microgliale a été augmentée par cytométrie en flux, qui a montré une augmentation de la viabilité cellulaire après le tri. À l’aide de la cytométrie de flux et des marqueurs de population de cellules RT-qPCR, on a analysé avant et après le tri des cellules CD11b positives du cerveau de souris au huitième jour postnatal. Ces analyses ont distingué diverses populations de cellules cérébrales, telles que CX3CR135 pour la microglie, O4 ou OLIG2 pour les oligodendrocytes, NeuN ou synaptophysine, pour les neurones, et ACSA-2, ou GFAP pour les astrocytes.Après tri cellulaire à l’aide d’anticorps CD11b, seules les microglies ont été obtenues. Il est important de pipeter très doucement tout en ajoutant la suspension à la colonne pour éviter le colmatage et éviter la mort mécanique des cellules. Après cette méthode, la protéomique transcriptomique, comme le sang occidental, ou Luminex, et même l’immunochimie peuvent être effectuées afin de voir l’effet de la stimulation microgliale.

Research

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