Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Die Forschung wird von Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco und einem zusätzlichen Zuschuss von Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS und Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. finanziert.

Das Protokoll wurde genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den institutionellen Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankreich) behandelt. Die magnetische Isolierung von Mikroglia aus den Gehirnen von 24 OF1-Mauswelpen (sowohl männlich als auch weiblich) bei P8, unterteilt in 6-Well-, 12-Well- oder 96-Well-Platten, wird vorgestellt. Die experimentelle Arbeit wurde unter einer Haube durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.
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Die aktuelle Arbeit präsentiert eine primäre Mikrogliazellkultur mit magnetisch sortierten CD11b+-Zellen. Neben der mikroglialen Funktionsbewertung (RT-qPCR und phagozytäre Assays) wurde auch die Reinheit der Mikrogliakultur bestimmt.
Klassische Mikroglia-Zellkulturen werden üblicherweise aus P1- oder P2-Nagetier-Neugeborenengehirn und Co-Kultur mit Astrozyten für mindestens 10 Tage erzeugt. Mikroglia werden dann mechanisch mit einem Orbitalschüttler getrennt. Die Methode zur Isolierung ...

Mikroglia sind die im zentralen Nervensystem ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen, die von erythropoetischen Vorläufern des Dottersacks abstammen, die während der frühen Embryonalentwicklung in das Neuroepithel wandern1. Neben ihren Immunitätsfunktionen spielen sie auch eine wichtige Rolle während der Neuroentwicklung, insbesondere bei der Synaptogenese, neuronalen Homöostase und Myelinisierung2. Im Erwachsenenalter entwickeln Mikroglia lange zelluläre Prozesse, um die Umgebung kontinuierlich zu scannen. Im Falle von Homöostaserupturen wie Hirnverletzungen oder Gehirnerkrankungen können Mikroglia ihr morphologisches Aussehen verändern, um eine amöboide Form anzunehmen, in den verletzten Bereich zu wandern, viele zytoprotektive oder zytotoxische Faktoren zu erhöhen und freizusetzen. Mikroglia haben heterogene Aktivierungszustände, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium und der Art der erlittenen Verletzung 3,4,5. In dieser Studie werden diese Aktivierungszustände grob in drei verschiedene Phänotypen eingeteilt: entzündungsfördernd/phagozytisch, entzündungshemmend und immunregulatorisch, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Situation in Wirklichkeit wahrscheinlich komplexer ist6.
Die Untersuchung der In-vivo-Mikrogliaaktivierung und das Screening auf neuroprotektive Strategien in frühen Stadien der Gehirnentwicklung kann aufgrund (1) der Zerbrechlichkeit der Tiere vor dem Absetzen und (2) der geringen Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung darstellen. Daher werden In-vitro-Studien an Mikroglia häufig für Toxizität 7,8,9, neuroprotektive Strategien5,10,11,12,13,14 und Kokulturen 15,16,17,18,19,20,21 verwendet. . In-vitro-Studien können entweder Mikroglia-Zelllinien, Stammzell-abgeleitete Mikroglia oder primäre Mikroglia-Kultur verwenden. Alle diese Ansätze haben Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der anfänglichen biologischen Frage ab. Die Vorteile der Verwendung primärer Mikrogliakulturen sind der homogene genetische Hintergrund, die pathogenfreie Geschichte und die Kontrolle des Zeitpunkts, zu dem die Mikroglia nach dem Tiertod stimuliert werden22.
Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden (Durchflusszytometrie, Schütteln oder magnetische Markierung) entwickelt, um primäre Mikroglia von Nagetieren zu kultivieren, sowohl Neugeborenen als auch Erwachsenen 23,24,25,26,27,28,29. In der vorliegenden Arbeit wird die Mikroglia-Isolierung von Maus-Neugeborenen-Welpen unter Verwendung der zuvor beschriebenen magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie unter Verwendung von mikroperlenbeschichtetem Anti-Maus-CD11b25,27,29 durchgeführt. CD11b ist ein Integrinrezeptor, der an der Oberfläche myeloischer Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimiert wird. Wenn es keine entzündliche Herausforderung im Gehirn gibt, sind fast alle CD11b + -Zellen Mikroglia30. Im Vergleich zu anderen zuvor veröffentlichten Methoden 23,24,25,26,27,28,29 gleicht das vorliegende Protokoll sofortige Ex-vivo-Mikroglia-Aktivierungsanalysen und gängige primäre In-vitro-Mikrogliakulturen aus. So werden Mikroglia (1) am postnatalen Tag (P)8 ohne Myelinentfernung isoliert, (2) ohne Serum kultiviert und (3) erst 48 h nach der Gehirnisolierung entweder siRNA, miRNA, pharmakologischen Verbindungen und/oder entzündlichen Reizen ausgesetzt. Jeder dieser drei Aspekte macht das aktuelle Protokoll relevant und schnell. Erstens ermöglicht die Verwendung von pädiatrischen Mikroglia die Gewinnung dynamischer und reaktiver lebensfähiger Zellen in Kultur, ohne dass ein zusätzlicher Demyelinisierungsschritt erforderlich ist, der möglicherweise die Mikroglia-Reaktivität in vitro verändern könnte. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, der physiologischen Umgebung von Mikroglia so nahe wie möglich zu kommen. Tatsächlich treffen Mikroglia nie auf Serum, und dieses Protokoll erfordert auch nicht die Verwendung von Serum. Darüber hinaus verhindert die Freilegung von Mikroglia bereits 48 Stunden nach der Kultur, dass sie ihre physiologischen Fähigkeiten verlieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Mikroglia, als hirnresidente Makrophagen, sind grundlegend für mehrere Funktionen, einschließlich der Reaktion auf Umweltstress und Gehirnhomöostase. Mikroglia können ein großes Spektrum von Aktivierungsphänotypen annehmen. Darüber hinaus sind Mikroglia, die den proinflammatorischen Phänotyp unterstützen, sowohl mit neurologischen Entwicklungsstörungen als auch mit neurodegenerativen Störungen assoziiert. In-vitro-Studien werden häufig in der Forschung eingesetzt, um mögliche therapeutische Strategien in bestimmten Zelltypen zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Mikrogliaaktivierung und Neuroinflammation in vitro unter Verwendung primärer Mikrogliakulturen relevanter als Mikrogliazelllinien oder Stammzell-abgeleitete Mikroglia. Die Verwendung einiger Primärkulturen könnte jedoch unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden. Dieses Protokoll schlägt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen vor. Mikroglia-Aktivierung mit mehreren Stimuli nach 4 h und 24 h durch mRNA-Expressionsquantifizierung und einen Cy3-Bead Phagozyten-Assay wird hier demonstriert. Die aktuellen Arbeiten sollen eine leicht reproduzierbare Technik zur Isolierung physiologisch relevanter Mikroglia aus juvenilen Entwicklungsstadien liefern.

Mikroglia ist der ZNS-residente Makrophag, der aktiviert wird, wenn er Umweltproblemen (Trauma, toxische Moleküle, Entzündungen) ausgesetzt ist4,5,6,34 (Abbildung 3A). In-vitro-Studien an Mikroglia werden häufig verwendet, um zellautonome Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Umweltherausforderungen zu bewerten und den Aktivierungszustand nach pharmako...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Mikroglia unter Bedingungen zu kultivieren, die die In-vivo-Eigenschaften genau nachahmen. Mit Hilfe der Magnetzellensortiertechnologie ermöglicht uns unser Protokoll, Mikroglia nur zwei Tage in vitro zu stimulieren, ohne Serum im Kulturmedium zu verwenden. Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um die Haut vom Hals bis zur Nase zu schneiden, indem Sie der sagittalen Naht von 15 bis 20 Millimetern folgen.Führen Sie die Spitzen mit dem Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite zu den Augen schneiden. Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen.Greifen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in der Nähe der Riechkolben und reißen Sie vorsichtig den Schädel auf. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und die olfaktorische Birne und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke. Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 40 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium.Dissoziationsmischung gemäß dieser Tabelle vorbereiten. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke in ein C-Röhrchen für ein Gesamtgewicht von 1,2 Gramm pro Dissoziationsröhrchen. Legen Sie dann C-Rohre auf den Dissoziator mit Erwärmung.Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Dissoziator. Zentrifugieren für 20 Sekunden. Schließen Sie die mechanische Dissoziation durch dreimaliges Pipettieren ab.Die Zellen werden in vier 15-Milliliter-Röhrchen mit angebrachten Sieben überführt. Spülen Sie die Siebe mit 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium ab. 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette entfernen.Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium hinzu und suspendieren Sie das Pellet erneut. Wieder zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.Wiederholen Sie die Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 200 Mikroliter CD11b-Mikroperlenlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen für 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet mit acht Milliliter Sortierpuffer. Folgen Sie als Nächstes dem Possel-Programm auf dem Trennzeichen, um acht Spalten vorzubereiten. Führen Sie die Zellen durch die Säule, indem Sie jeweils einen Milliliter Zellsuspension hinzufügen.Mit einem Milliliter Sortierpuffer CD11b-positive Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte eluieren. Bündeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren und suspendieren Sie das Pellet mit 10 Milliliter kaltem Mikrogliamedium.Zählen Sie die CD11b-positiven Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium, um eine Endkonzentration von 650.000 bis 700.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Die Suspension wird in Zellkulturplatten abgegeben.Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch ein vorgewärmtes Mikrogliamedium und wiederholen Sie die Inkubation über Nacht. Stimulieren Sie die Zellen vor diesem Schritt und führen Sie während der letzten drei Stunden der Stimulation einen phagozytischen Assay durch.Berechnen Sie die Anzahl der Perlen gemäß dieser Tabelle im Verhältnis 50 Perlen pro Zelle. Bereiten Sie die Perlenmischung vor. Inkubieren Sie das Röhrchen für eine Stunde in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Wirbel alle 10 Minuten. Zu jeder Vertiefung das berechnete Volumen der Perlenlösung hinzufügen und drei Stunden lang inkubieren. Mit diesem Ansatz wurde die phagozytische Aktivität von Mikroglia nach Stimulation durch entzündungsfördernde Faktoren wie Interleukin-1 beta plus Interferon gamma oder Lipopolysaccharide bewertet.Nach sechs- bis 24-stündiger Stimulation wurden fluoreszierende Cy3-Mikroglia-Beads konfokalmikroskopisch analysiert. Nach sechs Stunden beginnen Mikroglia, Cy3-Perlen nur unter Interleukin-1 beta plus Interferon-gamma-Bedingung zu phagozyten. Nach 24 Stunden gab es einen Anstieg der Cy3-Fluoreszenz für beide Arten der Stimulation, was eine erhöhte phagozytische Aktivität hervorhob.Die Reinheit der Mikrogliakultur wurde durch Durchflusszytometrie erhöht, was eine Erhöhung der Zelllebensfähigkeit nach der Sortierung zeigte. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie und RT-qPCR wurden Zellpopulationsmarker vor und nach dem Sortieren von CD11b-positiven Zellen aus Mäusegehirnen am postnatalen achten Tag analysiert. Diese Analysen unterschieden verschiedene Gehirnzellpopulationen, wie CX3CR135 für Mikroglia, O4 oder OLIG2 für Oligodendrozyten, NeuN oder Synaptophysin für Neuronen und ACSA-2 oder GFAP für Astrozyten.Nach der Zellsortierung mit CD11b-Antikörpern wurden nur Mikroglia erhalten. Es ist wichtig, sehr vorsichtig zu pipettieren, während die Suspension in die Säule gegeben wird, um Verstopfungen zu vermeiden und den mechanischen Zelltod zu vermeiden. Nach dieser Methode kann transkriptomische Proteomik wie westliches Blut oder Luminex und sogar Immunchemie durchgeführt werden, um die Wirkung der Mikrogliastimulation zu sehen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

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Neurowissenschaften

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Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

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