Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

आंकड़े बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे। अनुसंधान को इंसरम, यूनिवर्सिटी डी पेरिस, होराइजन 2020 (प्रेमस्टेम -874721), फोंडेशन डी फ्रांस, फोंडेशन एआरएसईपी, फोंडेशन पोर ला रेचेरचे सुर ले सेरव्यू, फोंडेशन ग्रेस डी मोनाको द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और निवेश डी'एवेनिर-एएनआर-11-आईएनबीएस-0011-न्यूराट्रिस और इनवेस्टिसमेंट डी'एवेनिर-एएनआर-17-ईयूईआर-001-EUR से अतिरिक्त अनुदान दिया जाता है।

प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी गई थी, और सभी जानवरों को इंस्टीट्यूट नेशनल डे ला सैंटे एट डे ला रेचरचे साइंटिफिक (इंसरम, फ्रांस) के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया था। पी 8 पर 24 ओएफ 1 माउस पिल्ले (नर औ...

वर्तमान कार्य चुंबकीय रूप से क्रमबद्ध सीडी 11 बी + कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्राथमिक माइक्रोग्लियल सेल संस्कृति प्रस्तुत करता है। माइक्रोग्लियल कार्यात्मक मूल्यांकन (आरटी-क्यूपीसीआर और फागोसाइटिक ?...

माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी मैक्रोफेज जैसी कोशिकाएं हैं जो जर्दी थैली के एरिथ्रोपोइटिक अग्रदूतों से प्राप्त होती हैं जो प्रारंभिकभ्रूण के विकास के दौरान न्यूरोएपिथेलियम में स्थानांतरित होती हैं। उनके प्रतिरक्षा कार्यों के अलावा, वे न्यूरोडेवलपमेंट के दौरान भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सिनैप्टोजेनेसिस, न्यूरोनल होमियोस्टेसिस और माइलिनेशन2 के लिए। वयस्कता में, माइक्रोग्लिया पर्यावरण को लगातार स्कैन करने के लिए लंबी सेलुलर प्रक्रियाओं को विकसित करता है। मस्तिष्क की चोट या मस्तिष्क रोग जैसे होमियोस्टैसिस टूटने के मामले में, माइक्रोग्लिया एक अमीबॉइड आकार को अपनाने के लिए अपनी रूपात्मक उपस्थिति को बदल सकता है, घायल क्षेत्र में पलायन कर सकता है, कई साइटोप्रोटेक्टिव या साइटोटोक्सिक कारकों को बढ़ा सकता है और छोड़ सकता है। माइक्रोग्लिया में उनके विकास चरण और चोट के प्रकार के आधार पर विषम सक्रियण अवस्थाएं होती हैं। इस अध्ययन में, इन सक्रियण राज्यों को मोटे तौर पर तीन अलग-अलग फेनोटाइप्स में वर्गीकृत किया जाता है: प्रो-इंफ्लेमेटरी / फागोसाइटिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनो-रेगुलेटरी, यह ध्यान में रखते हुए कि वास्तव में, स्थितिअधिक जटिल होने की संभावना है।
मस्तिष्क के विकास के शुरुआती चरणों में न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों के लिए विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण और स्क्रीनिंग में अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है (1) खरपतवार से पहले जानवरों की नाजुकता और (2) माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की कम संख्या। इसलिए माइक्रोग्लिया पर इन विट्रो अध्ययन व्यापक रूप से विषाक्तता 7,8,9, न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों 5,10,11,12,13,14, और सह-संस्कृतियों 15,16,17,18,19,20,21 के लिए उपयोग किए जाते हैं . इन विट्रो अध्ययन या तो माइक्रोग्लियल सेल लाइनों, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया, या प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति का उपयोग कर सकते हैं। इन सभी दृष्टिकोणों के फायदे और नुकसान हैं, और विकल्प प्रारंभिक जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है। प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग करने के लाभ समरूप आनुवंशिक पृष्ठभूमि, रोगज़नक़-मुक्त इतिहास और उस समय का नियंत्रण है जब माइक्रोग्लिया जानवरों की मृत्यु के बाद उत्तेजित होताहै।
वर्षों से, नवजात शिशुओं और वयस्क 23,24,25,26,27,28,29 दोनों से प्राथमिक माइक्रोग्लिया की खेती के लिए विभिन्न तरीकों (फ्लो साइटोमेट्री, शेकिंग, या चुंबकीय लेबलिंग) को विकसित किया गया था। वर्तमान काम में, माउस नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया अलगाव पहले वर्णित चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग तकनीक का उपयोग करके माइक्रोबीड-लेपित एंटी-माउस सीडी 11 बी 25,27,29 का उपयोग करके किया जाता है। सीडी 11 बी एक इंटीग्रिन-रिसेप्टर है जो माइक्रोग्लिया सहित माइलॉयड कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जाता है। जब मस्तिष्क के भीतर कोई भड़काऊ चुनौती नहीं होती है, तो लगभग सभी सीडी 11 बी + कोशिकाएं माइक्रोग्लिया30 होती हैं। अन्य पहले प्रकाशित विधियों 23,24,25,26,27,28,29 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल तत्काल पूर्व विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण विश्लेषण और आम इन विट्रो प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृति को संतुलित करता है। इस प्रकार, माइक्रोग्लिया (1) प्रसवोत्तर दिन (पी) 8 में माइलिन हटाने के बिना अलग होते हैं, (2) सीरम के बिना सुसंस्कृत होते हैं, और (3) मस्तिष्क अलगाव के केवल 48 घंटे बाद सीआरएनए, एमआईआरएनए, फार्माकोलॉजिकल यौगिक और / या भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में आते हैं। इन तीन पहलुओं में से प्रत्येक वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रासंगिक और तेज बनाता है। सबसे पहले, बाल चिकित्सा माइक्रोग्लिया का उपयोग एक अतिरिक्त डिमाइलिनेशन चरण की आवश्यकता के बिना संस्कृति में गतिशील और प्रतिक्रियाशील व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति देता है जो संभावित रूप से विट्रो में माइक्रोग्लियल प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइक्रोग्लिया के शारीरिक वातावरण के जितना संभव हो उतना करीब आना है। दरअसल, माइक्रोग्लिया कभी भी सीरम का सामना नहीं करता है, और इस प्रोटोकॉल को सीरम के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, संस्कृति के बाद 48 घंटे की शुरुआत में माइक्रोग्लिया को उजागर करने से उन्हें अपने शारीरिक संकायों को खोने से रोका जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज के रूप में, पर्यावरणीय तनाव और मस्तिष्क होमियोस्टेसिस की प्रतिक्रिया सहित कई कार्यों के लिए मौलिक हैं। माइक्रोग्लिया सक्रियण फेनोटाइप के एक बड़े स्पेक्ट्रम को अपना सकता है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया जो प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप का समर्थन करता है, न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों दोनों से जुड़ा हुआ है। विशिष्ट सेल प्रकारों में संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए अनुसंधान में इन विट्रो अध्ययनों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस संदर्भ में प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृतियों का उपयोग करके विट्रो में माइक्रोग्लियल सक्रियण और न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करना माइक्रोग्लियल सेल लाइनों या स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया की तुलना में अधिक प्रासंगिक है। हालांकि, कुछ प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग प्रजनन क्षमता की कमी से पीड़ित हो सकता है। यह प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का प्रस्ताव करता है। एमआरएनए अभिव्यक्ति परिमाणीकरण और एक Cy3-मोती फागोसाइटिक परख द्वारा 4 घंटे और 24 घंटे के बाद कई उत्तेजनाओं का उपयोग करके माइक्रोग्लियल सक्रियण यहां प्रदर्शित किया गया है। वर्तमान कार्य से किशोर विकास चरणों से शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करने की उम्मीद है।

माइक्रोग्लिया सीएनएस निवासी मैक्रोफेज है जो पर्यावरणीय चुनौतियों (आघात, विषाक्त अणुओं, सूजन) 4,5,6,34 (चित्रा 3 ए) के संपर्क में आने पर सक्रिय हो जाता है।<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग आमतौर पर नए विरोधी भड़काऊ अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का वर्णन करता है।

प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों के लिए नवजात माउस से माइक्रोग्लियल कोशिकाओं का चुंबकीय अलगाव

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

यह प्रोटोकॉल हमें उन स्थितियों में माइक्रोग्लिया को कल्चर करने की अनुमति देता है जो विवो विशेषताओं में बारीकी से नकल करते हैं। चुंबकीय सेल सॉर्टिंग तकनीक का उपयोग करके, हमारा प्रोटोकॉल हमें संस्कृति माध्यम में किसी भी सीरम का उपयोग किए बिना, विट्रो में केवल दो दिन माइक्रोग्लिया को उत्तेजित करने की अनुमति देता है। शुरू करने के लिए, गर्दन से नाक तक त्वचा को काटने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें, 15 से 20 मिलीमीटर की सीवन के बाद।खोपड़ी के समानांतर फोरमैन मैग्नम के साथ युक्तियों को डालें। दोनों तरफ से आंखों तक काट लें। खोपड़ी और मस्तिष्क को सिर से अलग करने के लिए छोटी कैंची से आंखों के बीच काटें।दो बलों के साथ, खोपड़ी को घ्राण बल्बों के करीब पकड़ें, और खोपड़ी को सावधानीपूर्वक फाड़ दें। रेजर ब्लेड के साथ, सेरिबैलम और ओल्फएक्टिव बल्ब को हटा दें, और मस्तिष्क को दो टुकड़ों में काट लें। मस्तिष्क के टुकड़ों को कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 40 मिलीलीटर एचबीएसएस युक्त पेट्री डिश में रखें।इस तालिका के अनुसार पृथक्करण मिश्रण तैयार करें। 1.2 ग्राम प्रति पृथक्करण ट्यूब के कुल वजन के लिए 12 मस्तिष्क के टुकड़ों को सी ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर सी ट्यूबों को हीटिंग के साथ डिसोसिएटर पर रखें।अलग-अलग में अनुकूलित NTDK प्रोग्राम प्रारंभ करें। 20 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज। यांत्रिक पृथक्करण को तीन बार पाइप करके पूरा करें।कोशिकाओं को संलग्न छन्नी के साथ चार 15-मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 10 मिलीलीटर एचबीएसएस के साथ छन्नी को धोएं। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए, और 10-मिलीलीटर पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।सावधानी से कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 10 मिलीलीटर एचबीएसएस जोड़ें, और गोली को फिर से निलंबित करें। फिर से, सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें। छंटाई बफर के छह मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। फिर सीडी 11 बी माइक्रोबीड समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूबों को चार डिग्री सेल्सियस पर 15 से 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, छंटाई बफर के छह मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और आठ मिलीलीटर सॉर्टिंग बफर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, आठ कॉलम तैयार करने के लिए विभाजक पर पोसेल प्रोग्राम का पालन करें। एक समय में एक मिलीलीटर सेल निलंबन जोड़कर कोशिकाओं को कॉलम के माध्यम से पास करें।एक मिलीलीटर सॉर्टिंग बफर के साथ, एक बाँझ क्षालन प्लेट पर सीडी 11 बी-पॉजिटिव कोशिकाएं होती हैं। कोशिकाओं को 50-मिलीलीटर ट्यूब में पूल करें। सेंट्रीफ्यूज और 10 मिलीलीटर ठंडे माइक्रोग्लिया माध्यम के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।सीडी 11 बी-पॉजिटिव कोशिकाओं की गणना करें। ठंडे माइक्रोग्लिया माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ताकि प्रति मिलीलीटर 650, 000 से 700, 000 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके। सेल कल्चर प्लेटों में निलंबन वितरित करें।प्लेटों को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, माध्यम को पहले से गर्म माइक्रोग्लिया माध्यम से बदलें, और रात भर के इनक्यूबेशन को दोहराएं। इस चरण से पहले कोशिकाओं को उत्तेजित करें, और उत्तेजना के अंतिम तीन घंटों के दौरान फागोसाइटिक परख करें।इस तालिका के अनुसार मोतियों की संख्या की गणना 50 मोतियों प्रति सेल के अनुपात पर करें। मोतियों का मिश्रण तैयार करें। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।वोर्टेक्स हर 10 मिनट में। प्रत्येक कुएं में, मोती समाधान की गणना की मात्रा जोड़ें और तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, माइक्रोग्लिया की फागोसाइटिक गतिविधि का मूल्यांकन प्रो-भड़काऊ कारकों, जैसे इंटरल्यूकिन -1 बीटा, प्लस इंटरफेरॉन गामा, या लिपोपॉलेसेकेराइड द्वारा उत्तेजना के बाद किया गया था।छह से 24 घंटे के लिए उत्तेजना के बाद, फ्लोरोसेंट Cy3 माइक्रोग्लिया मोतियों का विश्लेषण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा किया गया था। छह घंटे के बाद, माइक्रोग्लिया केवल इंटरल्यूकिन -1 बीटा प्लस इंटरफेरॉन गामा स्थिति के तहत फागोसाइट साइ 3 मोती शुरू करता है। 24 घंटों के बाद, दोनों प्रकार की उत्तेजना के लिए Cy3 प्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई, जिससे फागोसाइटिक गतिविधि में वृद्धि हुई।माइक्रोग्लियल संस्कृति की शुद्धता को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा बढ़ाया गया था, जिसने छंटाई के बाद सेल व्यवहार्यता में वृद्धि दिखाई। फ्लो साइटोमेट्री और आरटी-क्यूपीसीआर सेल जनसंख्या मार्करों का उपयोग करके प्रसवोत्तर दिन आठ में चूहों के दिमाग से सीडी 11 बी-पॉजिटिव कोशिकाओं को छांटने से पहले और बाद में विश्लेषण किया गया था। इन विश्लेषणों ने विभिन्न मस्तिष्क कोशिका आबादी को अलग किया, जैसे कि माइक्रोग्लिया के लिए सीएक्स 3सीआर 135, ओ 4, या ओलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए ओएलआईजी 2, न्यूरॉन्स के लिए न्यून, या सिनैप्टोफिसिन, और एस्ट्रोसाइट्स के लिए एसीएसए -2, या जीएफएपी।सीडी 11 बी एंटीबॉडी का उपयोग करके सेल सॉर्टिंग के बाद, केवल माइक्रोग्लिया प्राप्त किए गए थे। क्लॉगिंग को रोकने और यांत्रिक कोशिका मृत्यु से बचने के लिए कॉलम में निलंबन जोड़ते समय बहुत धीरे से पिपेट करना महत्वपूर्ण है। इस विधि के बाद, ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोटिओमिक्स, जैसे पश्चिमी रक्त, या ल्यूमिनेक्स, और यहां तक कि इम्यूनोकैमिस्ट्री को माइक्रोग्लियल उत्तेजना के प्रभाव को देखने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

एकाधिक माउस Neuroanatomical चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

अलगाव और भ्रूण murine तंत्रिका ट्यूब से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की संस्कृति

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

एक माउस, दो संस्कृतियों: अलगाव और वयस्क तंत्रिका की संस्कृति व्यक्तिगत चूहों के दो तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से स्टेम सेल

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

प्राथमिक Murine मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं का अलगाव

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

बढ़ी पवित्रता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ प्राथमिक Microglia का तेजी से और रिफाइंड CD11b चुंबकीय अलगाव

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

अलगाव और भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

प्राथमिक मुरीन कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथीलियल कोशिकाओं के अलगाव

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

भ्रूणीय माउस सेरिबैलम से अलग न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

डेमाइलिनेशन के पशु मॉडल में चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा माउस प्राथमिक माइक्रोग्लिया का अलगाव

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...