Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Le figure sono state create utilizzando BioRender. La ricerca è finanziata da Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco e una sovvenzione aggiuntiva da Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Il protocollo è stato approvato e tutti gli animali sono stati gestiti secondo le linee guida istituzionali dell'Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Viene presentato l'isolamento magnetico della microglia dal cervello di 24 cuccioli di topo OF1 (sia maschi che femmine) a P8, suddivisi in piastre a 6 pozzetti, 12 pozzetti o 96 pozzetti. Il lavoro sperimentale è stato eseguito sotto un cappuccio per mantenere condizioni sterili.
1. Preparazio...

Il lavoro attuale presenta una coltura primaria di cellule microgliali utilizzando cellule CD11b + ordinate magneticamente. Oltre alla valutazione funzionale microgliale (RT-qPCR e saggi fagocitici), è stata determinata anche la purezza della coltura microgliale.
Le colture cellulari di microglia classiche sono comunemente generate dal cervello neonato del roditore P1 o P2 e dalla co-coltura con astrociti per almeno 10 giorni. Le microglia vengono quindi separate meccanicamente utilizzando un...

Le microglia sono le cellule simili a macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale derivate da precursori eritropoietici del sacco vitellino che migrano verso il neuroepitelio durante lo sviluppo embrionale precoce1. Oltre alle loro funzioni immunitarie, svolgono anche un ruolo significativo durante lo sviluppo neurologico, in particolare per la sinaptogenesi, l'omeostasi neuronale e la mielinizzazione2. In età adulta, le microglia sviluppano lunghi processi cellulari per scansionare continuamente l'ambiente. In caso di rotture dell'omeostasi come lesioni cerebrali o malattie cerebrali, le microglia possono cambiare il loro aspetto morfologico per adottare una forma ameboide, migrare verso l'area lesa, aumentare e rilasciare molti fattori citoprotettivi o citotossici. Le microglia hanno stati di attivazione eterogenei a seconda del loro stadio di sviluppo e del tipo di lesione subita 3,4,5. In questo studio, questi stati di attivazione sono ampiamente classificati in tre diversi fenotipi: pro-infiammatori / fagocitici, antinfiammatori e immuno-regolatori, tenendo presente che in realtà la situazione è probabilmente più complessa6.
Studiare in vivo l'attivazione microgliale e lo screening per le strategie neuroprotettive nelle prime fasi dello sviluppo cerebrale può essere difficile a causa (1) della fragilità degli animali prima dello svezzamento e (2) del basso numero di cellule microgliali. Pertanto gli studi in vitro sulle microglia sono ampiamente utilizzati per tossicità 7,8,9, strategie neuroprotettive5,10,11,12,13,14 e co-colture 15,16,17,18,19,20,21 . Gli studi in vitro possono utilizzare linee cellulari microgliali, microglia derivate da cellule staminali o colture di microglia primarie. Tutti questi approcci hanno vantaggi e svantaggi e la scelta dipende dalla domanda biologica iniziale. I vantaggi dell'utilizzo di colture primarie di microglia sono il background genetico omogeneo, la storia priva di agenti patogeni e il controllo del momento in cui le microglia vengono stimolate dopo la morte dell'animale22.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi metodi (citometria a flusso, scuotimento o marcatura magnetica) per la coltura di microglia primaria da roditori, sia neonati che adulti 23,24,25,26,27,28,29. Nel presente lavoro, l'isolamento della microglia da cuccioli di topo neonato viene eseguito utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata magneticamente precedentemente descritta utilizzando CD11b 25,27,29 anti-topo rivestito di microsfere. CD11b è un recettore dell'integrina espresso sulla superficie delle cellule mieloidi, compresa la microglia. Quando non c'è sfida infiammatoria all'interno del cervello, quasi tutte le cellule CD11b + sono microglia30. Rispetto ad altri metodi precedentemente pubblicati 23,24,25,26,27,28,29, il presente protocollo bilancia le analisi immediate di attivazione microgliale ex vivo e la comune coltura microgliale primaria in vitro. Pertanto, le microglia sono (1) isolate al giorno postnatale (P) 8 senza rimozione della mielina, (2) coltivate senza siero e (3) esposte a siRNA, miRNA, composti farmacologici e / o stimoli infiammatori solo 48 ore dopo l'isolamento cerebrale. Ciascuno di questi tre aspetti rende l'attuale protocollo rilevante e rapido. Innanzitutto, l'utilizzo della microglia pediatrica consente di ottenere cellule vitali dinamiche e reattive in coltura senza richiedere un ulteriore step demielinico che potrebbe potenzialmente modificare la reattività microgliale in vitro. Il presente protocollo mira ad avvicinarsi il più possibile all'ambiente fisiologico della microglia. In effetti, le microglia non incontrano mai il siero e questo protocollo non richiede nemmeno l'uso del siero. Inoltre, esporre le microglia già 48 ore dopo la coltura impedisce loro di perdere le loro facoltà fisiologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Le microglia, come macrofagi residenti nel cervello, sono fondamentali per diverse funzioni, tra cui la risposta allo stress ambientale e l'omeostasi cerebrale. La microglia può adottare un ampio spettro di fenotipi di attivazione. Inoltre, le microglia che sostengono il fenotipo pro-infiammatorio sono associate a disturbi sia dello sviluppo neurologico che neurodegenerativi. Gli studi in vitro sono ampiamente utilizzati nella ricerca per valutare potenziali strategie terapeutiche in specifici tipi di cellule. In questo contesto, lo studio dell'attivazione microgliale e della neuroinfiammazione in vitro utilizzando colture microgliali primarie è più rilevante delle linee cellulari microgliali o delle microglia derivate dalle cellule staminali. Tuttavia, l'uso di alcune colture primarie potrebbe soffrire di una mancanza di riproducibilità. Questo protocollo propone un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati. L'attivazione microgliale utilizzando diversi stimoli dopo 4 ore e 24 ore mediante quantificazione dell'espressione dell'mRNA e un saggio fagocitico Cy3-bead è dimostrato qui. Il lavoro attuale dovrebbe fornire una tecnica facilmente riproducibile per isolare microglia fisiologicamente rilevanti dagli stadi di sviluppo giovanile.

La microglia è il macrofago residente nel SNC che viene attivato quando esposto a sfide ambientali (traumi, molecole tossiche, infiammazione)4,5,6,34 (Figura 3A). Gli studi in vitro sulle microglia sono comunemente usati per valutare i meccanismi autonomi delle cellule correlati a tali sfide ambientali e caratterizzare lo stato di attivazione dopo manipol...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Questo protocollo ci permette di coltivare microglia in condizioni che imitano da vicino le caratteristiche in vivo. Utilizzando la tecnologia di selezione delle cellule magnetiche, il nostro protocollo ci consente di stimolare la microglia solo due giorni in vitro, senza utilizzare alcun siero nel terreno di coltura. Per iniziare, usa piccole forbici per tagliare la pelle dal collo al naso, seguendo la sutura sagittale da 15 a 20 millimetri.Inserire le punte con il forame magno parallelo al cranio. Tagliare da ogni lato agli occhi. Tagliare tra gli occhi con piccole forbici per staccare il cranio e il cervello dalla testa.Con due pinze, afferrare il cranio vicino ai bulbi olfattivi e strappare con cura il cranio. Con una lama di rasoio, rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo e tagliare il cervello in due pezzi. Posizionare i pezzi di cervello in una capsula di Petri contenente 40 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio.Preparare la miscela di dissociazione secondo questa tabella. Trasferire 12 pezzi di cervello in un tubo C per un peso totale di 1,2 grammi per tubo di dissociazione. Quindi posizionare i tubi C sul dissociatore con riscaldamento.Avviare il programma NTDK ottimizzato nel dissociatore. Centrifugare per 20 secondi. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio tre volte.Trasferire le celle in quattro tubi da 15 millilitri con filtri collegati. Risciacquare i filtri con 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio. Centrifugare per 10 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 millilitri.Aggiungere con cautela 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio e risospendere il pellet. Ancora una volta, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.Ripetere la centrifugazione ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di microsfere CD11b e incubare i tubi per 15-20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet con otto millilitri di tampone di selezione. Quindi, seguire il programma Possel sul separatore per preparare otto colonne. Passare le celle attraverso la colonna aggiungendo un millilitro di sospensione cellulare alla volta.Con un millilitro di tampone di selezione, eluire le cellule CD11b-positive su una piastra di eluizione sterile. Raggruppa le celle in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare e risospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo microglia freddo.Contare le cellule CD11b-positive. Ri-sospendere le cellule nel mezzo microglia freddo per ottenere una concentrazione finale da 650.000 a 700.000 cellule per millilitro. Erogare la sospensione in piastre di coltura cellulare.Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo microglia preriscaldato e ripetere l'incubazione notturna. Stimolare le cellule prima di questa fase ed eseguire il test fagocitario durante le ultime tre ore della stimolazione.Calcola il numero di perline secondo questa tabella con un rapporto di 50 perle per cella. Preparare la miscela di perline. Incubare il tubo per un'ora a bagnomaria a 37 gradi Celsius.Vortice ogni 10 minuti. A ciascun pozzetto, aggiungere il volume calcolato della soluzione di perline e incubare per tre ore. Utilizzando questo approccio, l'attività fagocitaria della microglia è stata valutata dopo la stimolazione da fattori pro-infiammatori, come l'interleuchina-1 beta, più interferone gamma o lipopolisaccaridi.Dopo la stimolazione da sei a 24 ore, le sfere fluorescenti della microglia Cy3 sono state analizzate al microscopio confocale. Dopo sei ore, la microglia inizia a falciare le perle Cy3 solo in condizioni di interleuchina-1 beta più interferone gamma. Dopo 24 ore, c'è stato un aumento della fluorescenza Cy3 per entrambi i tipi di stimolazione, evidenziando un aumento dell'attività fagocitaria.La purezza della coltura microgliale è stata elevata dalla citometria a flusso, che ha mostrato un aumento della vitalità cellulare dopo la selezione. Utilizzando la citometria a flusso e i marcatori di popolazione cellulare RT-qPCR sono stati analizzati prima e dopo aver selezionato cellule CD11b-positive dal cervello dei topi all'ottavo giorno postnatale. Queste analisi hanno distinto varie popolazioni di cellule cerebrali, come CX3CR135 per microglia, O4 o OLIG2 per oligodendrociti, NeuN o sinaptofisina, per i neuroni e ACSA-2 o GFAP per astrociti.Dopo la selezione cellulare con l'anticorpo CD11b, sono state ottenute solo microglia. È importante pipettare molto delicatamente mentre si aggiunge la sospensione alla colonna per evitare l'intasamento ed evitare la morte meccanica delle cellule. Dopo questo metodo, la proteomica trascrittomica, come il sangue occidentale, o Luminex, e persino l'immunochimica possono essere eseguite per vedere l'effetto della stimolazione microgliale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...