Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。

議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。
<p class="jove_...

現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。
古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービ?...

ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。
脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ないため、困難な場合があります。したがって、ミクログリアに関するin vitro研究は、毒性7、8、9、神経保護戦略5、10、11、12、13、14、および共培養15、16、17、18、19、20、21に広く使用されています。.インビトロ研究では、ミクログリア細胞株、幹細胞由来のミクログリア、または初代ミクログリア培養のいずれかを使用できます。これらすべてのアプローチには長所と短所があり、選択は最初の生物学的問題によって異なります。初代ミクログリア培養を使用する利点は、均質な遺伝的背景、病原体のない履歴、および動物の死後にミクログリアが刺激される時間の制御です22。
長年にわたり、新生児と成人の両方のげっ歯類から一次ミクログリアを培養するためのさまざまな方法(フローサイトメトリー、振とう、または磁気標識)が開発されました23、24、25、26、27、28、29。本研究では、マウス新生児仔からのミクログリア単離を、マイクロビーズコーティング抗マウスCD11b25,27,29を用いた既述の磁気活性化細胞選別技術を用いて行う。CD11bは、ミクログリアを含む骨髄系細胞の表面に発現するインテグリン受容体です。脳内に炎症性の問題がない場合、ほとんどすべてのCD11b +細胞はミクログリア30です。以前に発表された他の方法23、24、25、26、27、28、29と比較して、本プロトコルは、即時のex vivoミクログリア活性化分析および一般的なin vitro初代ミクログリア培養のバランスをとる。したがって、ミクログリアは、(1)ミエリン除去なしで(P)8生後日に単離され、(2)血清なしで培養され、(3)脳単離後わずか48時間でsiRNA、miRNA、薬理学的化合物、および/または炎症刺激のいずれかに曝露されます。これらの3つの側面のそれぞれは、現在のプロトコルを関連性があり迅速なものにします。まず第一に、小児ミクログリアの使用は、インビトロでミクログリア反応性を潜在的に改変する可能性のある追加の脱髄ステップを必要とせずに、培養中の動的で反応性の生存細胞を得ることを可能にする。本プロトコルは、ミクログリアの生理学的環境にできるだけ近づけることを目的とする。実際、ミクログリアは血清に遭遇することはなく、このプロトコルも血清の使用を必要としません。さらに、培養後48時間という早い時期にミクログリアを曝露することで、ミクログリアが生理学的能力を失うことを防ぎます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。

ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

このプロトコルにより、in vivo特性を厳密に模倣する条件でミクログリアを培養することができます。磁気セルソーティング技術を使用して、私たちのプロトコルは、培養培地に血清を使用せずに、in vitroでわずか2日間ミクログリアを刺激することを可能にします。まず、小さなハサミを使用して、15〜20ミリメートルの矢状縫合糸に従って、首から鼻までの皮膚を切ります。頭蓋骨と平行な大孔で先端を挿入します。両側から目まで切ります。小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します。2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球の近くでつかみ、慎重に頭蓋骨を引き裂きます。かみそりの刃で、小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります。カルシウムとマグネシウムを含まない40ミリリットルのHBSSを含むペトリ皿に脳片を置きます。この表に従って解離混合物を調製する。12個の脳片をCチューブに移し、解離チューブあたり総重量1.2グラムにします。次に、加熱しながらCチューブをディソシエーターに置きます。最適化された NTDK プログラムをディソシエータで起動します。20秒間遠心分離します。ピペッティングを3回行うことで機械的解離を完了します。ストレーナーが取り付けられた4本の15ミリリットルチューブにセルを移します。カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSでストレーナーをすすぎます。10分間遠心分離し、10ミリリットルのピペットで上清を除去する。カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSを慎重に加え、ペレットを再懸濁します。再度、遠心分離し、上清を除去する。ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てる。次に、200マイクロリットルのCD11bマイクロビーズ溶液を加え、摂氏4度で15〜20分間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、ペレットを8ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。次に、セパレーターのポッセルプログラムに従って、8つの列を準備します。一度に1ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって細胞をカラムに通す。1ミリリットルのソーティングバッファーで、滅菌溶出プレート上でCD11b陽性細胞を溶出します。細胞を50ミリリットルのチューブにプールします。遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの冷たいミクログリア培地で再懸濁します。CD11b陽性細胞をカウントします。細胞を冷たいミクログリア培地に再懸濁して、ミリリットルあたり650, 000〜700, 000細胞の最終濃度を得ます。懸濁液を細胞培養プレートに分注します。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、培地を予熱したミクログリア培地と交換し、一晩インキュベーションを繰り返します。このステップの前に細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に貪食アッセイを実行します。この表に従って、セルあたり50ビーズの比率でビーズの数を計算します。ビーズ混合物を調製する。チューブを摂氏37度の水浴中で1時間インキュベートする。10分ごとに渦を巻きます。各ウェルに、計算された量のビーズ溶液を加え、3時間インキュベートします。このアプローチを使用して、インターロイキン-1ベータ、インターフェロンガンマ、またはリポ多糖などの炎症誘発因子による刺激後にミクログリアの食作用活性を評価しました。6〜24時間の刺激後、蛍光Cy3ミクログリアビーズを共焦点顕微鏡で分析した。6時間後、ミクログリアはインターロイキン-1ベータとインターフェロンガンマ条件下でのみCy3ビーズを貪食し始める。24時間後、両方の種類の刺激でCy3蛍光が増加し、食作用活性の増加が強調されました。ミクログリア培養物の純度はフローサイトメトリーによって上昇し、選別後の細胞生存率の増加を示しました。フローサイトメトリーおよびRT-qPCR細胞集団マーカーを用いて、生後8日目にマウス脳からCD11b陽性細胞を選別する前後を分析した。これらの解析により、ミクログリアのCX3CR135、希突起膠細胞のO4またはOLIG2、ニューロンのNeuNまたはシナプトフィジン、星状細胞用のACSA-2またはGFAPなど、さまざまな脳細胞集団が区別されました。CD11b抗体を用いた細胞選別後、ミクログリアのみが得られた。カラムに懸濁液を添加しながら非常に穏やかにピペットでピペットを装着することは、目詰まりを防ぎ、機械的細胞死を避けるために重要です。この方法の後、ミクログリア刺激の効果を確認するために、西洋血液やLuminexなどのトランスクリプトームプロテオミクス、さらには免疫化学を行うことができます。

Research

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Neuroscience

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