Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

피규어는 바이오렌더를 사용하여 생성되었습니다. 연구는 Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation de France, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, Investissement d' Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 및 Investissement d' Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.의 추가 보조금을 지원합니다.

프로토콜은 승인되었고 모든 동물은 Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France)의 기관 지침에 따라 처리되었습니다. 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트로 분할된 P8에서 24개의 OF1 마우스 새끼(수컷과 암컷 모두)의 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리가 제시됩니다. 실험 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 후드 하에서 수행되었습니다.
1. 분리 및 세포 배양을 위?...

현재 연구는 자기적으로 분류된 CD11b+ 세포를 사용하는 1차 소교세포 배양을 제시합니다. 소교세포 기능 평가(RT-qPCR 및 식세포 분석) 외에도 미세아교세포 배양 순도도 측정되었습니다.
고전적인 미세아교세포 세포 배양은 일반적으로 P1 또는 P2 설치류 신생아 뇌에서 생성되고 최소 10일 동안 성상교세포와 공동 배양됩니다. 그런 다음 미세아교세포를 오비탈 셰이커를 사용하?...

미세아교세포는 초기 배아 발달 동안 신경 상피로 이동하는 난황낭의 적혈구 생성 전구체에서 유래한 중추신경계에 상주하는 대식세포 유사 세포입니다1. 면역 기능 외에도 신경 발달 중, 특히 시냅스 형성, 신경 항상성 및 수초화2에 중요한 역할을합니다. 성인기에 미세아교세포는 환경을 지속적으로 스캔하기 위해 긴 세포 과정을 발달시킵니다. 뇌 손상이나 뇌 질환과 같은 항상성 파열의 경우, 미세 아교 세포는 형태 학적 모양을 변경하여 아메보이드 모양을 채택하고 손상된 부위로 이동하여 많은 세포 보호 또는 세포 독성 인자를 증가 및 방출 할 수 있습니다. 미세아교세포는 발달 단계와 3,4,5 지속되는 부상 유형에 따라 이질적인 활성화 상태를 갖습니다. 이 연구에서 이러한 활성화 상태는 크게 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : 전 염증 / 식세포, 항 염증 및 면역 조절, 실제로는 상황이 더 복잡 할 가능성이 있음을 명심하십시오6.
생체 내 소교세포 활성화를 연구하고 뇌 발달 초기 단계에서 신경 보호 전략을 스크리닝하는 것은 (1) 이유 전 동물의 취약성과 (2) 소교세포 수가 적기 때문에 어려울 수 있습니다. 따라서 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 독성 7,8,9, 신경 보호 전략 5,10,11,12,13,14 및 공동 배양 15,16,17,18,19,20,21에 널리 사용됩니다. . 시험관 내 연구는 소교세포주, 줄기세포 유래 미세아교세포 또는 1차 미세아교세포 배양을 사용할 수 있습니다. 이러한 모든 접근법에는 장점과 단점이 있으며 선택은 초기 생물학적 질문에 달려 있습니다. 1차 미세아교세포 배양을 사용하는 이점은 균질한 유전적 배경, 병원체가 없는 이력 및 동물 사망 후 미세아교세포가 자극되는 시간의 제어입니다22.
 수년에 걸쳐, 설치류, 신생아 및 성인 23,24,25,26,27,28,29 모두로부터 1 차 미세 아교 세포를 배양하기위한 다양한 방법 (유세포 분석, 진탕 또는 자기 표지)이 개발되었습니다. 본 연구에서, 마우스 신생아 새끼로부터의 미세아교세포 분리는 마이크로비드-코팅된 항-마우스 CD11b25,27,29를 사용하여 이전에 기술된 자기-활성화 세포 분류 기술을 사용하여 수행된다. CD11b는 미세아교세포를 포함한 골수성 세포의 표면에서 발현되는 인테그린 수용체이다. 뇌 내에 염증 문제가 없을 때 거의 모든 CD11b+ 세포는 미세아교세포30입니다. 이전에 발표된 다른 방법 23,24,25,26,27,28,29와 비교 하여, 본 프로토콜은 즉각적인 생체외 미세아교세포 활성화 분석과 일반적인 시험관 내 1차 미세아교세포 배양의 균형을 맞춘다. 따라서 미세아교세포는 (1) 미엘린 제거 없이 출생 후 (P)8에 분리되고, (2) 혈청 없이 배양되며, (3) 뇌 분리 후 48시간 만에 siRNA, miRNA, 약리학적 화합물 및/또는 염증 자극에 노출됩니다. 이 세 가지 측면 각각은 현재 프로토콜을 적절하고 빠르게 만듭니다. 우선, 소아 미세아교세포의 사용은 잠재적으로 시험관 내에서 미세아교세포 반응성을 수정할 수 있는 추가적인 탈수초 단계를 요구하지 않고 배양에서 역동적이고 반응성이 있는 생존 세포를 얻을 수 있게 한다. 본 프로토콜은 미세아교세포의 생리적 환경에 가능한 한 근접하는 것을 목표로 한다. 실제로, 미세 아교 세포는 혈청을 만나지 않으며,이 프로토콜은 혈청을 사용할 필요도 없습니다. 또한 배양 후 48 시간 만에 미세 아교 세포를 노출하면 생리 능력을 잃지 않습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 환경 스트레스에 대한 반응과 뇌 항상성을 포함한 여러 기능의 기본입니다. 미세아교세포는 광범위한 활성화 표현형을 채택할 수 있습니다. 또한, 전 염증성 표현형을지지하는 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애와 관련이 있습니다. 시험관 내 연구는 특정 세포 유형에서 잠재적 인 치료 전략을 평가하기위한 연구에 널리 사용됩니다. 이러한 맥락에서 일차 소교세포 배양을 사용하여 시험관 내에서 미세아교세포 활성화 및 신경염증을 연구하는 것이 소교세포 세포주 또는 줄기세포 유래 미세아교세포보다 더 관련이 있습니다. 그러나 일부 1 차 배양의 사용은 재현성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 새끼에서 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 제안합니다. mRNA 발현 정량화 및 Cy3-비드 식세포 분석에 의한 4시간 및 24시간 후 여러 자극을 사용한 미세아교세포 활성화가 여기에서 입증됩니다. 현재의 연구는 청소년 발달 단계에서 생리 학적으로 관련된 미세 아교 세포를 분리하기위한 쉽게 재현 가능한 기술을 제공 할 것으로 기대된다.

미세아교세포는 환경적 문제(외상, 독성 분자, 염증)4,5,6,34에 노출될 때 활성화되는 CNS 상주 대식세포입니다(그림 3A). 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 일반적으로 이러한 환경적 문제와 관련된 세포 자율 메커니즘을 평가하고 약리학적 또는 유전적 조작 후 활성화...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

이 프로토콜을 통해 우리는 생체 내 특성을 밀접하게 모방하는 조건에서 미세아교세포를 배양할 수 있습니다. 자성 세포 분류 기술을 사용하는 당사의 프로토콜을 사용하면 배양 배지에서 혈청을 사용하지 않고 시험관 내에서 이틀만 미세아교세포를 자극할 수 있습니다. 시작하려면 작은 가위를 사용하여 15-20 밀리미터의 시상 봉합사 후 목에서 코까지 피부를 자릅니다.구멍 매그넘이 두개골과 평행하도록 팁을 삽입하십시오. 양쪽에서 눈으로 자릅니다. 작은 가위로 눈 사이를 잘라 머리에서 두개골과 뇌를 분리하십시오.두 개의 집게로 후각 구근에 가까운 두개골을 잡고 조심스럽게 두개골을 찢습니다. 면도날로 소뇌와 후각 전구를 제거하고 뇌를 두 조각으로 자릅니다. 칼슘과 마그네슘이없는 40 밀리리터의 HBSS가 들어있는 페트리 접시에 뇌 조각을 넣으십시오.이 표에 따라 해리 혼합물을 준비하십시오. 12개의 뇌 조각을 C 튜브로 옮기면 해리 튜브당 총 무게가 1.2g입니다. 그런 다음 가열로 디스 소시아 이터에 C 튜브를 놓습니다.디소시아터에서 최적화된 NTDK 프로그램을 시작합니다. 20 초 동안 원심 분리기. 피펫팅을 세 번 하여 기계적 해리를 완료합니다.스트레이너가 부착 된 4 개의 15 밀리리터 튜브로 세포를 옮깁니다. 칼슘과 마그네슘이 함유 된 HBSS 10ml로 여과기를 헹굽니다. 10분 동안 원심분리하고, 10밀리리터 피펫으로 상층액을 제거한다.칼슘과 마그네슘이 함유 된 HBSS 10 밀리리터를 조심스럽게 첨가하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다시, 원심분리하여 상청액을 제거한다. 6 밀리리터의 분류 버퍼로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.원심분리를 반복하고 상청액을 버린다. 그런 다음 200 마이크로리터의 CD11b 마이크로비드 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 15 내지 20분 동안 튜브를 배양한다. 배양 후, 6 밀리리터의 분류 완충액으로 펠렛을 다시 현탁시킨다.원심분리를 반복하고 8밀리리터의 분류 완충액으로 펠릿을 다시 현탁시킨다. 다음으로 구분 기호의 Possel 프로그램에 따라 8 개의 열을 준비합니다. 한 번에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 추가하여 컬럼을 통해 세포를 통과시킵니다.1밀리리터의 분류 완충액을 사용하여 멸균 용리 플레이트에서 CD11b 양성 세포를 용리합니다. 세포를 50 밀리리터 튜브에 모으십시오. 원심분리하고 10ml의 차가운 미세아교세포 배지로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.CD11b 양성 세포를 세십시오. 밀리리터 당 650, 000 내지 700, 000 세포의 최종 농도를 얻기 위해 차가운 미세아교세포 배지에 세포를 재현탁시킨다. 세포 배양 플레이트에 현탁액을 분주한다.플레이트를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다. 다음날, 배지를 예열 된 미세 아교 세포 배지로 교체하고 밤새 배양을 반복하십시오. 이 단계 전에 세포를 자극하고, 자극의 마지막 3시간 동안 식세포 분석을 수행한다.이 표에 따라 셀당 50개의 비드 비율로 비드 수를 계산합니다. 비드 혼합물을 준비하십시오. 섭씨 37 도의 수조에서 1 시간 동안 튜브를 배양하십시오.10 분마다 소용돌이. 각 웰에, 계산된 부피의 비드 용액을 첨가하고 3시간 동안 배양한다. 이 접근법을 사용하여, 마이크로 아교 세포의 식세포 활성은 인터루킨 -1 베타, 인터페론 감마 또는 지질 다당류와 같은 전 염증 인자에 의한 자극 후 평가되었다.6 내지 24시간 동안 자극한 후, 형광 Cy3 미세아교세포 비드를 공초점 현미경으로 분석하였다. 6시간 후, 미세아교세포는 인터루킨-1 베타와 인터페론 감마 조건에서만 Cy3 비드를 식세포화하기 시작합니다. 24 시간 후, 두 종류의 자극에 대해 Cy3 형광이 증가하여 증가 된 식세포 활성을 강조했습니다.미세아교세포 배양의 순도는 유세포분석에 의해 상승되었으며, 이는 분류 후 세포 생존율의 증가를 보였다. 유세포분석기 및 RT-qPCR 세포 집단 마커를 사용하여 출생 후 8일째에 마우스 뇌로부터 CD11b-양성 세포를 분류하기 전후에 분석하였다. 이러한 분석은 미세아교세포에 대한 CX3CR135, 희소돌기아교세포에 대한 O4 또는 OLIG2, 뉴런에 대한 NeuN 또는 시냅토피신, 성상교세포에 대한 ACSA-2 또는 GFAP와 같은 다양한 뇌 세포 집단을 구별했습니다.CD11b 항체를 이용한 세포 분류 후, 미세아교세포만을 수득하였다. 막힘을 방지하고 기계적 세포 사멸을 방지하기 위해 컬럼에 현탁액을 추가하는 동안 매우 부드럽게 피펫팅하는 것이 중요합니다. 이 방법 후에, 서양 혈액 또는 Luminex와 같은 전사체 단백질체학, 심지어 면역 화학이 미세 아교 세포 자극의 효과를보기 위해 수행 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

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It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

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Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

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Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...