Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Figurer ble opprettet ved hjelp av BioRender. Forskning er finansiert av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et tilleggsstipend fra Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Protokollen ble godkjent, og alle dyrene ble håndtert i henhold til de institusjonelle retningslinjene til Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolasjon av mikroglia fra hjernen til 24 OF1 musevalper (både mannlige og kvinnelige) ved P8, delt inn i 6-brønns, 12-brønns eller 96-brønnplater, presenteres. Det eksperimentelle arbeidet ble utført under en hette for å opprettholde sterile forhold.
1. Fremstilling av sterile løsn...

Det nåværende arbeidet presenterer en primær mikroglial cellekultur ved hjelp av magnetisk sorterte CD11b + celler. I tillegg til mikroglial funksjonsevaluering (RT-qPCR og fagocytiske analyser) ble også mikrogliakulturrenhet bestemt.
Klassiske microglia cellekulturer er vanligvis generert fra P1 eller P2 gnager nyfødte hjernen og co-kultur med astrocytter i minst 10 dager. Microglia separeres deretter mekanisk ved hjelp av en orbital shaker. Metoden for å isolere og dyrke mikroglia ...

Microglia er makrofaglignende celler i sentralnervesystemet avledet fra erytropoetiske forløpere til plommesekken som migrerer til nevroepitelet under tidlig embryonal utvikling1. Bortsett fra deres immunitetsfunksjoner, spiller de også en betydelig rolle under nevroutvikling, spesielt for synaptogenese, nevronhomeostase ogmyelinisering. I voksen alder utvikler mikroglia lange cellulære prosesser for å skanne miljøet kontinuerlig. Ved homeostasebrudd som hjerneskade eller hjernesykdom, kan mikroglia endre sitt morfologiske utseende for å vedta en amoeboid form, migrere til det skadede området, øke og frigjøre mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstander avhengig av utviklingsstadiet og typen skade som ble påført 3,4,5. I denne studien er disse aktiveringstilstandene bredt klassifisert i tre forskjellige fenotyper: pro-inflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunregulatorisk, med tanke på at situasjonen i virkeligheten sannsynligvis vil være mer kompleks6.
Studier in vivo mikroglial aktivering og screening for nevrobeskyttende strategier i tidlige stadier av hjernens utvikling kan være utfordrende på grunn av (1) skjørheten til dyr før avvenning og (2) det lave antallet mikrogliaceller. Derfor er in vitro-studier på mikroglia mye brukt for toksisitet 7,8,9, nevrobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og kokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan bruke enten mikrogliacellelinjer, stamcelleavledet mikroglia eller primær mikrogliakultur. Alle disse tilnærmingene har fordeler og ulemper, og valget avhenger av det første biologiske spørsmålet. Fordelene ved å bruke primære mikrogliakulturer er den homogene genetiske bakgrunnen, patogenfri historie og kontroll av tiden da mikroglia stimuleres etter dyredød22.
Gjennom årene ble forskjellige metoder (flowcytometri, risting eller magnetisk merking) utviklet for dyrking av primær mikroglia fra gnagere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbeidet utføres mikroglia-isolering fra musenyfødte valper ved bruk av tidligere beskrevet magnetisk aktivert cellesorteringsteknologi ved bruk av mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreseptor uttrykt på overflaten av myeloide celler, inkludert mikroglia. Når det ikke er noen inflammatorisk utfordring i hjernen, er nesten alle CD11b+-celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere publiserte metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserer den nåværende protokollen umiddelbare ex vivo mikrogliale aktiveringsanalyser og vanlig in vitro primær mikroglialkultur. Dermed blir mikroglia (1) isolert på postnatal dag (P)8 uten fjerning av myelin, (2) dyrket uten serum, og (3) eksponert enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og/eller inflammatoriske stimuli bare 48 timer etter hjerneisolering. Hvert av disse tre aspektene gjør den nåværende protokollen relevant og rask. Først og fremst tillater bruk av pediatrisk mikroglia å oppnå dynamiske og reaktive levedyktige celler i kultur uten å kreve et ekstra demyeliniseringstrinn som potensielt kan modifisere mikroglial reaktivitet in vitro. Den nåværende protokollen tar sikte på å komme så nært som mulig til det fysiologiske miljøet til microglia. Faktisk møter microglia aldri serum, og denne protokollen krever heller ikke bruk av serum. Videre forhindrer eksponering av mikroglia så tidlig som 48 timer etter kultur at de mister sine fysiologiske fakulteter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Microglia, som hjernen bosatt makrofager, er grunnleggende for flere funksjoner, inkludert respons på miljøstress og hjernen homeostase. Microglia kan ta i bruk et stort spekter av aktiveringsfenotyper. Videre er mikroglia som støtter proinflammatorisk fenotype forbundet med både nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser. In vitro-studier er mye brukt i forskning for å evaluere potensielle terapeutiske strategier i bestemte celletyper. I denne sammenheng er det mer relevant å studere mikrogliaaktivering og nevroinflammasjon in vitro ved bruk av primære mikrogliakulturer enn mikroglialcellelinjer eller stamcelleavledet mikroglia. Imidlertid kan bruken av noen primære kulturer lide av mangel på reproduserbarhet. Denne protokollen foreslår en reproduserbar og relevant metode for magnetisk isolering av mikroglia fra nyfødte valper. Mikroglial aktivering ved bruk av flere stimuli etter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspresjonskvantifisering og en Cy3-perlefagocytisk analyse er demonstrert her. Det nåværende arbeidet forventes å gi en lett reproduserbar teknikk for å isolere fysiologisk relevant mikroglia fra juvenile utviklingsstadier.

Microglia er den CNS-bosatte makrofagen som aktiveres når den utsettes for miljøutfordringer (traumer, giftige molekyler, betennelse) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia brukes ofte til å evaluere celleautonome mekanismer relatert til disse miljøutfordringene og karakterisere aktiveringstilstanden etter farmakologisk eller genetisk mani...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Primære mikrogliakulturer brukes ofte til å evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Denne protokollen beskriver en reproduserbar og relevant metode for magnetisk å isolere mikroglia fra nyfødte valper.

Magnetisk isolasjon av mikroglialceller fra nyfødt mus for primære cellekulturer

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Denne protokollen tillater oss å dyrke microglia under forhold som nøye etterligner in vivo-egenskapene. Ved hjelp av magnetisk cellesorteringsteknologi tillater protokollen oss å stimulere mikroglia bare to dager in vitro, uten å bruke serum i kulturmediet. For å begynne, bruk liten saks for å kutte huden fra nakken til nesen, etter sagittal sutur på 15 til 20 millimeter.Sett spissene med foramen magnum parallelt med skallen. Klipp fra hver side til øynene. Klipp mellom øynene med liten saks for å løsne skallen og hjernen fra hodet.Med to tang, ta tak i skallen nær olfaktoriske pærer, og riv skallen forsiktig. Med et barberblad, fjern lillehjernen og olfactive pære, og kutt hjernen i to stykker. Plasser hjernebitene i en petriskål som inneholder 40 milliliter HBSS uten kalsium og magnesium.Forbered dissosiasjonsblanding i henhold til denne tabellen. Overfør 12 hjernestykker til et C-rør for en totalvekt på 1,2 gram per dissosiasjonsrør. Legg deretter C-rør på dissosieren med oppvarming.Start det optimaliserte NTDK-programmet i dissociateren. Sentrifuge i 20 sekunder. Fullfør den mekaniske dissosiasjonen ved pipettering tre ganger.Overfør cellene til fire 15 milliliter rør med vedlagte siler. Skyll silene med 10 ml HBSS med kalsium og magnesium. Sentrifuge i 10 minutter, og fjern supernatanten med en 10 milliliter pipette.Tilsett forsiktig 10 ml HBSS med kalsium og magnesium, og suspendere pelleten på nytt. Igjen, sentrifuger og fjern supernatanten. Stopp pelleten på nytt med seks milliliter sorteringsbuffer.Gjenta sentrifugeringen og kast supernatanten. Tilsett deretter 200 mikroliter CD11b mikroperleoppløsning og inkuber rørene i 15 til 20 minutter ved fire grader Celsius. Etter inkubasjon, suspendere pelleten med seks milliliter sorteringsbuffer.Gjenta sentrifugeringen og heng pelleten på nytt med åtte milliliter sorteringsbuffer. Følg deretter Possel-programmet på separatoren for å forberede åtte kolonner. Pass cellene gjennom kolonnen ved å legge til en milliliter cellesuspensjon om gangen.Med en milliliter sorteringsbuffer, eluere CD11b-positive celler på en steril elueringsplate. Samle cellene i et 50 milliliter rør. Sentrifuge og suspendere pelleten på nytt med 10 ml kaldt mikrogliamedium.Tell de CD11b-positive cellene. Re-suspendere cellene i kaldt microglia medium for å få en endelig konsentrasjon på 650.000 til 700.000 celler per milliliter. Dispenser suspensjonen i cellekulturplater.Inkuber platene over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Neste dag, erstatt mediet med forvarmet mikrogliamedium, og gjenta inkubasjonen over natten. Stimuler cellene før dette trinnet, og utfør fagocytisk analyse i løpet av de siste tre timene av stimuleringen.Beregn antall perler i henhold til denne tabellen i forholdet 50 perler per celle. Forbered perleblandingen. Inkuber røret i en time i et vannbad ved 37 grader Celsius.Vortex hvert 10. minutt. Til hver brønn, legg til det beregnede volumet av perleløsningen og inkuber i tre timer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble fagocytisk aktivitet av mikroglia evaluert etter stimulering av proinflammatoriske faktorer, som interleukin-1 beta, pluss interferon gamma eller lipopolysakkarider.Etter stimulering i seks til 24 timer ble fluorescerende Cy3 microglia-perler analysert med konfokalt mikroskop. Etter seks timer begynner mikroglia å fagocytt Cy3 perler bare under interleukin-1 beta pluss interferon gamma tilstand. Etter 24 timer var det en økning av Cy3-fluorescens for begge typer stimulering, noe som fremhever økt fagocytisk aktivitet.Renheten av mikrogliakultur ble forhøyet ved flowcytometri, som viste en økning i cellens levedyktighet etter sortering. Ved hjelp av flowcytometri og RT-qPCR-cellepopulasjonsmarkører ble analysert før og etter sortering av CD11b-positive celler fra musehjerner på barseldag åtte. Disse analysene skilte forskjellige hjernecellepopulasjoner, for eksempel CX3CR135 for mikroglia, O4 eller OLIG2 for oligodendrocytter, NeuN eller synaptophysin, for nevroner og ACSA-2, eller GFAP for astrocytter.Etter cellesortering med CD11b-antistoff ble kun mikroglia oppnådd. Det er viktig å pipette veldig forsiktig mens du legger suspensjonen til kolonnen for å forhindre tilstopping og unngå mekanisk celledød. Etter denne metoden kan transkriptomisk proteomikk, som vestlig blod, eller Luminex, og til og med immunokjemi utføres for å se effekten av mikroglialstimulering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primary murine Brain mikrovaskulære Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Rask og raffinert CD11b Magnetic Isolering av Primary Microglia med Enhanced Purity og allsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolasjon og kultur av embryonale mus embryonale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolering av musens primære mikroglia ved magnetisk aktivert cellesortering i dyremodeller av demyelinering

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...