Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

As figuras foram criadas usando BioRender. A investigação é financiada pela Inserm, Université de Paris, Horizonte 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, e uma subvenção adicional do Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

O protocolo foi aprovado e todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes institucionais do Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, França). O isolamento magnético da micróglia dos cérebros de 24 filhotes de camundongos OF1 (machos e fêmeas) em P8, divididos em placas de 6 poços, 12 ou 96 poços, são apresentados. O trabalho experimental foi realizado sob um capô para manter as condições estéreis.
1. Preparação de soluções est...

O presente trabalho apresenta uma cultura primária de células microgliais usando células CD11b+ classificadas magneticamente. Além da avaliação funcional microglial (RT-qPCR e ensaios fagocíticos), a pureza da cultura microglial também foi determinada.
Culturas clássicas de células de micróglias são comumente geradas a partir do cérebro de recém-nascidos de roedores P1 ou P2 e co-cultura com astrócitos por pelo menos 10 dias. As micróglias são então separadas mecanicamente us...

Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial1. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização2. Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua aparência morfológica para adotar uma forma de ameboide, migrar para a área lesada, aumentar e liberar muitos fatores citoprotetores ou citotóxicos. As micróglias apresentam estados de ativação heterogêneos dependendo do seu estágio de desenvolvimento e do tipo de lesão sofrida 3,4,5. Neste estudo, esses estados de ativação são amplamente classificados em três fenótipos diferentes: pró-inflamatório/fagocítico, anti-inflamatório e imunorregulador, tendo em vista que, na realidade, a situação provavelmente será mais complexa6.
Estudar a ativação microglial in vivo e a triagem de estratégias neuroprotetoras nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral podem ser desafiadores devido (1) à fragilidade dos animais antes do desmame e (2) ao baixo número de células microgliais. Portanto, estudos in vitro sobre micróglias são amplamente utilizados para toxicidade 7,8,9, estratégias neuroprotetoras5,10,11,12,13,14 e coculturas 15,16,17,18,19,20,21 . Estudos in vitro podem usar linhagens celulares microgliais, microglia derivada de células-tronco ou cultura de micróglia primária. Todas essas abordagens têm vantagens e desvantagens, e a escolha depende da questão biológica inicial. Os benefícios do uso de culturas primárias de micróglias são o fundo genético homogêneo, a história livre de patógenos e o controle do momento em que as micróglias são estimuladas após a morte animal22.
Ao longo dos anos, diferentes métodos (citometria de fluxo, agitação ou marcação magnética) foram desenvolvidos para a cultura de micróglias primárias de roedores, tanto recém-nascidos quanto adultos 23,24,25,26,27,28,29. No presente trabalho, o isolamento de micróglias de filhotes de camundongos recém-nascidos é realizado utilizando-se a tecnologia de classificação de células ativadas magneticicamente descritas anteriormente, utilizando CD11b anti-camundongo revestido por microesferas25,27,29. CD11b é um receptor de integrina expresso na superfície das células mielóides, incluindo a micróglia. Quando não há desafio inflamatório dentro do cérebro, quase todas as células CD11b + são microglia30. Comparado a outros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, o presente protocolo equilibra análises de ativação microglial ex vivo imediata e cultura microglial primária in vitro comum. Assim, as micróglias são (1) isoladas no dia pós-natal (P)8 sem remoção de mielina, (2) cultivadas sem soro e (3) expostas a siRNA, miRNA, composto farmacológico e/ou estímulos inflamatórios apenas 48 h após o isolamento cerebral. Cada um desses três aspectos torna o protocolo atual relevante e rápido. Em primeiro lugar, o uso da micróglia pediátrica permite a obtenção de células viáveis dinâmicas e reativas em cultura sem a necessidade de uma etapa adicional de desmielinização que poderia potencialmente modificar a reatividade microglial in vitro. O presente protocolo tem como objetivo aproximar-se o máximo possível do ambiente fisiológico da micróglia. De fato, a micróglia nunca encontra soro, e esse protocolo também não requer o uso de soro. Além disso, expor a micróglia já 48 h após a cultura impede que eles percam suas faculdades fisiológicas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

A micróglia, como macrófagos residentes no cérebro, são fundamentais para várias funções, incluindo a resposta ao estresse ambiental e a homeostase cerebral. A micróglia pode adotar um grande espectro de fenótipos de ativação. Além disso, a micróglia que endossa o fenótipo pró-inflamatório está associada a distúrbios neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos. Estudos in vitro são amplamente utilizados em pesquisas para avaliar potenciais estratégias terapêuticas em tipos específicos de células. Neste contexto, estudar a ativação microglial e a neuroinflamação in vitro usando culturas microgliais primárias é mais relevante do que as linhagens celulares microgliais ou a microglia derivada de células-tronco. No entanto, o uso de algumas culturas primárias pode sofrer de falta de reprodutibilidade. Este protocolo propõe um método reprodutível e relevante de isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos. A ativação microglial utilizando vários estímulos após 4 h e 24 h por quantificação da expressão de mRNA e um ensaio fagocítico de esferas Cy3 é demonstrado aqui. Espera-se que o presente trabalho forneça uma técnica facilmente reprodutível para isolar micróglias fisiologicamente relevantes dos estágios de desenvolvimento juvenis.

A micróglia é o macrófago residente do SNC que é ativado quando exposto a desafios ambientais (trauma, moléculas tóxicas, inflamação)4,5,6,34 (Figura 3A). Estudos in vitro sobre micróglia são comumente usados para avaliar mecanismos autônomos celulares relacionados a esses desafios ambientais e caracterizar o estado de ativação após manipula?...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Este protocolo nos permite cultivar micróglias em condições que imitam de perto as características in vivo. Usando a tecnologia de classificação de células magnéticas, nosso protocolo nos permite estimular a micróglia apenas dois dias in vitro, sem usar nenhum soro no meio de cultura. Para começar, use uma pequena tesoura para cortar a pele do pescoço ao nariz, seguindo a sutura sagital de 15 a 20 milímetros.Insira as pontas com o forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado para os olhos. Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça.Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue cuidadosamente o crânio. Com uma lâmina de barbear, remova o cerebelo e o bulbo olfativo e corte o cérebro em dois pedaços. Coloque as peças cerebrais em uma placa de Petri contendo 40 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio.Prepare a mistura de dissociação de acordo com esta tabela. Transfira 12 peças cerebrais para um tubo C para um peso total de 1,2 gramas por tubo de dissociação. Em seguida, coloque tubos C no dissociador com aquecimento.Inicie o programa NTDK otimizado no dissociador. Centrífuga por 20 segundos. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes.Transfira as células para quatro tubos de 15 mililitros com filtros acoplados. Lave os filtros com 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio. Centrifugar por 10 minutos e remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mililitros.Adicione cuidadosamente 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio e ressuspenda o pellet. Novamente, centrifugar e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet com seis mililitros de buffer de classificação.Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de microesferas CD11b e incube os tubos por 15 a 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a incubação, ressuspeite o pellet com seis mililitros de tampão de classificação.Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet com oito mililitros de buffer de classificação. Em seguida, siga o programa Possel no separador para preparar oito colunas. Passe as células através da coluna adicionando um mililitro de suspensão celular de cada vez.Com um mililitro de tampão de classificação, elimine células CD11b-positivas em uma placa de eluição estéril. Junte as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar e ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio microglia fria.Conte as células CD11b positivas. Ressuspeite as células em meio microglia frio para obter uma concentração final de 650.000 a 700.000 células por mililitro. Dispensar a suspensão em placas de cultura celular.Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de micróglia pré-aquecido e repita a incubação durante a noite. Estimule as células antes desta etapa e realize o ensaio fagocítico durante as últimas três horas da estimulação.Calcule o número de contas de acordo com esta tabela em uma proporção de 50 contas por célula. Prepare a mistura de contas. Incube o tubo por uma hora em banho-maria a 37 graus Celsius.Vórtice a cada 10 minutos. A cada poço, adicione o volume calculado da solução de grânulos e incube por três horas. Usando essa abordagem, a atividade fagocítica da micróglia foi avaliada após a estimulação por fatores pró-inflamatórios, como interleucina-1 beta, mais interferon gama ou lipopolissacarídeos.Após estimulação por seis a 24 horas, as esferas fluorescentes da micróglia Cy3 foram analisadas por microscópio confocal. Após seis horas, a micróglia começa a fagocitar as esferas Cy3 apenas sob a condição de interleucina-1 beta mais interferon gama. Após 24 horas, houve aumento da fluorescência Cy3 para ambos os tipos de estimulação, destacando-se o aumento da atividade fagocítica.A pureza da cultura microglial foi elevada pela citometria de fluxo, que mostrou aumento da viabilidade celular após a triagem. Usando citometria de fluxo e marcadores de população de células RT-qPCR foram analisados antes e depois de classificar células CD11b-positivas de cérebros de camundongos no oitavo dia pós-natal. Essas análises distinguiram várias populações de células cerebrais, como CX3CR135 para microglia, O4 ou OLIG2 para oligodendrócitos, NeuN ou sinaptofisina, para neurônios, e ACSA-2, ou GFAP para astrócitos.Após a triagem celular com o anticorpo CD11b, apenas a micróglia foi obtida. É importante pipetar muito suavemente ao adicionar a suspensão à coluna para evitar o entupimento e evitar a morte mecânica das células. Após este método, a proteômica transcriptômica, como o sangue ocidental, ou Luminex, e até mesmo a imunoquímica podem ser realizadas para ver o efeito da estimulação microglial.

Research

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