Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
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Las figuras fueron creadas usando BioRender. La investigación está financiada por Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, y una subvención adicional de Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

El protocolo fue aprobado, y todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices institucionales del Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Se presenta el aislamiento magnético de la microglía del cerebro de 24 crías de ratón OF1 (tanto machos como hembras) en P8, divididas en placas de 6 pocillos, 12 pocillos o 96 pocillos. El trabajo experimental se realizó bajo una campana para mantener condiciones estériles.
1. Preparaci...

El trabajo actual presenta un cultivo primario de células microgliales utilizando células CD11b + clasificadas magnéticamente. Además de la evaluación funcional microglial (RT-qPCR y ensayos fagocíticos), también se determinó la pureza del cultivo microglial.
Los cultivos clásicos de células microgliales se generan comúnmente a partir del cerebro neonatal de roedores P1 o P2 y el cocultivo con astrocitos durante al menos 10 días. Las microglías se separan mecánicamente usando un ...

Las microglías son las células similares a los macrófagos residentes en el sistema nervioso central derivadas de precursores eritropoyéticos del saco vitelino que migran al neuroepitelio durante el desarrollo embrionario temprano1. Además de sus funciones de inmunidad, también juegan un papel importante durante el neurodesarrollo, particularmente para la sinaptogénesis, la homeostasis neuronal y la mielinización2. En la edad adulta, la microglía desarrolla largos procesos celulares para escanear el medio ambiente continuamente. En caso de rupturas de homeostasis como lesión cerebral o enfermedad cerebral, la microglía puede cambiar su apariencia morfológica para adoptar una forma ameboide, migrar a la zona lesionada, aumentar y liberar muchos factores citoprotectores o citotóxicos. Las microglías tienen estados de activación heterogéneos dependiendo de su etapa de desarrollo y del tipo de lesión sufrida 3,4,5. En este estudio, estos estados de activación se clasifican ampliamente en tres fenotipos diferentes: proinflamatorio/fagocítico, antiinflamatorio e inmunorregulador, teniendo en cuenta que, en realidad, la situación es probable que sea más compleja6.
El estudio de la activación microglial in vivo y la detección de estrategias neuroprotectoras en las primeras etapas del desarrollo cerebral puede ser un desafío debido a (1) la fragilidad de los animales antes del destete y (2) el bajo número de células microgliales. Por lo tanto, los estudios in vitro sobre la microglía son ampliamente utilizados para la toxicidad 7,8,9, las estrategias neuroprotectoras5,10,11,12,13,14 y los cocultivos 15,16,17,18,19,20,21 . Los estudios in vitro pueden utilizar líneas celulares microgliales, microglía derivada de células madre o cultivo primario de microglia. Todos estos enfoques tienen ventajas y desventajas, y la elección depende de la pregunta biológica inicial. Los beneficios del uso de cultivos primarios de microglia son los antecedentes genéticos homogéneos, la historia libre de patógenos y el control del momento en que la microglía es estimulada después de la muerte animal22.
A lo largo de los años, se desarrollaron diferentes métodos (citometría de flujo, agitación o marcado magnético) para cultivar microglia primaria de roedores, tanto neonatos como adultos 23,24,25,26,27,28,29. En el presente trabajo, el aislamiento de microglia de crías neonatales de ratón se realiza utilizando la tecnología de clasificación celular activada magnéticamente previamente descrita utilizando CD11b de ratón anti-ratón recubierto de microperlas25,27,29. CD11b es un receptor de integrina expresado en la superficie de las células mieloides, incluida la microglía. Cuando no hay un desafío inflamatorio dentro del cerebro, casi todas las células CD11b + son microglia30. En comparación con otros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, el presente protocolo equilibra los análisis de activación microglial ex vivo inmediato y el cultivo microglial primario in vitro común. Por lo tanto, las microglías son (1) aisladas en el día postnatal (P)8 sin eliminación de mielina, (2) cultivadas sin suero, y (3) expuestas a siRNA, miRNA, compuesto farmacológico y/o estímulos inflamatorios solo 48 h después del aislamiento cerebral. Cada uno de estos tres aspectos hace que el protocolo actual sea relevante y rápido. En primer lugar, el uso de la microglía pediátrica permite obtener células viables dinámicas y reactivas en cultivo sin requerir un paso adicional de desmielinización que podría modificar potencialmente la reactividad microglial in vitro. El presente protocolo tiene como objetivo acercarse lo más posible al entorno fisiológico de la microglía. De hecho, la microglía nunca encuentra suero, y este protocolo tampoco requiere el uso de suero. Además, la exposición de la microglía tan pronto como 48 h después del cultivo evita que pierdan sus facultades fisiológicas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

La microglía, como macrófagos residentes en el cerebro, es fundamental para varias funciones, incluida la respuesta al estrés ambiental y la homeostasis cerebral. La microglía puede adoptar un amplio espectro de fenotipos de activación. Además, la microglía que respalda el fenotipo proinflamatorio se asocia con trastornos del desarrollo neurológico y neurodegenerativos. Los estudios in vitro son ampliamente utilizados en la investigación para evaluar posibles estrategias terapéuticas en tipos específicos de células. En este contexto, el estudio de la activación microglial y la neuroinflamación in vitro utilizando cultivos microgliales primarios es más relevante que las líneas celulares microgliales o la microglía derivada de células madre. Sin embargo, el uso de algunos cultivos primarios puede adolecer de una falta de reproducibilidad. Este protocolo propone un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos. Aquí se demuestra la activación microglial utilizando varios estímulos después de 4 h y 24 h mediante la cuantificación de la expresión de ARNm y un ensayo fagocítico de perlas Cy3. Se espera que el trabajo actual proporcione una técnica fácilmente reproducible para aislar microglía fisiológicamente relevante de las etapas de desarrollo juvenil.

La microglía es el macrófago residente en el SNC que se activa cuando se expone a desafíos ambientales (trauma, moléculas tóxicas, inflamación)4,5,6,34 (Figura 3A). Los estudios in vitro sobre la microglía se utilizan comúnmente para evaluar los mecanismos autónomos celulares relacionados con esos desafíos ambientales y caracterizar el estado de ...

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Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Este protocolo nos permite cultivar microglia en condiciones que imitan de cerca las características in vivo. Utilizando la tecnología de clasificación celular magnética, nuestro protocolo nos permite estimular la microglía solo dos días in vitro, sin usar ningún suero en el medio de cultivo. Para empezar, utiliza tijeras pequeñas para cortar la piel desde el cuello hasta la nariz, siguiendo la sutura sagital de 15 a 20 milímetros.Inserte las puntas con el foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado hasta los ojos. Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza.Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue cuidadosamente el cráneo. Con una cuchilla de afeitar, retire el cerebelo y el bulbo olfativo, y corte el cerebro en dos pedazos. Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 40 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio.Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con esta tabla. Transfiera 12 piezas cerebrales a un tubo C para un peso total de 1,2 gramos por tubo de disociación. Luego coloque tubos C en el disociador con calefacción.Inicie el programa NTDK optimizado en el disociador. Centrifugar durante 20 segundos. Completa la disociación mecánica pipeteando tres veces.Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mililitros con filtros conectados. Enjuague los coladores con 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio. Centrifugar durante 10 minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mililitros.Agregue cuidadosamente 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio, y vuelva a suspender el pellet. Nuevamente, centrifugar y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego agregue 200 microlitros de solución de microperlas CD11b e incube los tubos durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.Repita la centrifugación y vuelva a suspender el pellet con ocho mililitros de tampón de clasificación. A continuación, siga el programa Possel en el separador para preparar ocho columnas. Pase las células a través de la columna agregando un mililitro de suspensión celular a la vez.Con un mililitro de tampón de clasificación, eluya las células CD11b positivas en una placa de elución estéril. Agrupe las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar y volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio microglia frío.Contar las células CD11b positivas. Vuelva a suspender las células en medio microglial frío para obtener una concentración final de 650, 000 a 700, 000 células por mililitro. Dispensar la suspensión en placas de cultivo celular.Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio microglial precalentado y repita la incubación durante la noche. Estimular las células antes de este paso, y realizar un ensayo fagocítico durante las últimas tres horas de la estimulación.Calcule el número de cuentas de acuerdo con esta tabla en una proporción de 50 cuentas por celda. Preparar la mezcla de cuentas. Incubar el tubo durante una hora en un baño de agua a 37 grados centígrados.Vórtice cada 10 minutos. A cada pozo, agregue el volumen calculado de la solución de perlas e incube durante tres horas. Usando este enfoque, la actividad fagocítica de la microglía se evaluó después de la estimulación por factores proinflamatorios, como la interleucina-1 beta, más interferón gamma o lipopolisacáridos.Después de la estimulación durante seis a 24 horas, las perlas fluorescentes de microglía Cy3 se analizaron con microscopio confocal. Después de seis horas, la microglía comienza a las perlas de fagocitos Cy3 solo bajo la condición de interleucina-1 beta más interferón gamma. Después de 24 horas, hubo un aumento de la fluorescencia Cy3 para ambos tipos de estimulación, destacando el aumento de la actividad fagocítica.La pureza del cultivo microglial se elevó mediante citometría de flujo, que mostró un aumento en la viabilidad celular después de la clasificación. Utilizando citometría de flujo y marcadores de población de células RT-qPCR se analizaron antes y después de clasificar las células CD11b positivas de cerebros de ratones en el día ocho postnatal. Estos análisis distinguieron varias poblaciones de células cerebrales, como CX3CR135 para microglia, O4 u OLIG2 para oligodendrocitos, NeuN o sinaptofisina, para neuronas, y ACSA-2, o GFAP para astrocitos.Después de la clasificación celular utilizando el anticuerpo CD11b, solo se obtuvieron microglías. Es importante pipetear muy suavemente mientras se agrega la suspensión a la columna para evitar obstrucciones y evitar la muerte celular mecánica. Después de este método, se puede realizar proteómica transcriptómica, como la sangre occidental o Luminex, e incluso inmunoquímica para ver el efecto de la estimulación microglial.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Investigación

Neurociencias

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