Name: magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Figurer skapades med BioRender. Forskningen finansieras av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco och ett ytterligare bidrag från Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS och Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Protokollet godkändes och alla djur hanterades enligt de institutionella riktlinjerna från Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolering av mikroglia från hjärnan hos 24 OF1-musvalpar (både manliga och kvinnliga) vid P8, uppdelad i 6-brunns-, 12-brunns- eller 96-brunnsplattor, presenteras. Det experimentella arbetet utfördes under en huva för att upprätthålla sterila förhållanden.
1. Beredning av sterila lösningar för...

Det aktuella arbetet presenterar en primär mikroglialcellodling med magnetiskt sorterade CD11b + -celler. Förutom den mikrogliala funktionella utvärderingen (RT-qPCR och fagocytiska analyser) bestämdes också mikroglialodlingsrenhet.
Klassiska mikrogliacellkulturer genereras vanligtvis från P1- eller P2-gnagare nyfödda hjärna och samodling med astrocyter i minst 10 dagar. Microglia separeras sedan mekaniskt med hjälp av en orbital shaker. Metoden att isolera och odla microglia in v...

Microglia är de makrofagliknande cellerna i centrala nervsystemet som härrör från erytropoietiska föregångare till äggula som migrerar till neuroepitelet under tidig embryonal utveckling1. Förutom deras immunitetsfunktioner spelar de också en viktig roll under neuroutveckling, särskilt för synaptogenes, neuronal homeostas och myelinering2. I vuxen ålder utvecklar microglia långa cellulära processer för att skanna miljön kontinuerligt. Vid homeostasbrott som hjärnskada eller hjärnsjukdom kan microglia ändra sitt morfologiska utseende för att anta en amoeboidform, migrera till det skadade området, öka och frigöra många cytoprotektiva eller cytotoxiska faktorer. Microglia har heterogena aktiveringstillstånd beroende på deras utvecklingsstadium och vilken typ av skada som uppstått 3,4,5. I denna studie klassificeras dessa aktiveringstillstånd i stort sett i tre olika fenotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk och immunreglerande, med tanke på att situationen i verkligheten sannolikt kommer att vara mer komplex6.
Att studera mikrogliaaktivering in vivo och screening för neuroprotektiva strategier i tidiga stadier av hjärnans utveckling kan vara utmanande på grund av (1) djurens bräcklighet före avvänjning och (2) det låga antalet mikrogliaceller. Därför används in vitro-studier på mikroglia i stor utsträckning för toxicitet 7,8,9, neuroprotektiva strategier5,10,11,12,13,14 och samkulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan använda antingen mikrogliala cellinjer, stamcellsderiverade mikroglia eller primär mikrogliakultur. Alla dessa tillvägagångssätt har fördelar och nackdelar, och valet beror på den ursprungliga biologiska frågan. Fördelarna med att använda primära mikrogliakulturer är den homogena genetiska bakgrunden, patogenfri historia och kontroll av den tid då mikroglia stimuleras efter djurdöd22.
Under åren utvecklades olika metoder (flödescytometri, skakning eller magnetisk märkning) för odling av primär mikroglia från gnagare, både nyfödda och vuxna 23,24,25,26,27,28,29. I detta arbete utförs mikrogliaisolering från musnyfödda ungar med hjälp av tidigare beskriven magnetaktiverad cellsorteringsteknik med hjälp av mikropärlbelagd antimus-CD11b25,27,29. CD11b är en integrinreceptor uttryckt vid ytan av myeloida celler, inklusive mikroglia. När det inte finns någon inflammatorisk utmaning i hjärnan är nästan alla CD11b + -celler microglia30. Jämfört med andra tidigare publicerade metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserar detta protokoll omedelbara ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser och vanlig in vitro primär mikroglialkultur. Således isoleras mikroglia (1) efter födseln (P) 8 utan myelinavlägsnande, (2) odlas utan serum och (3) exponeras antingen för siRNA, miRNA, farmakologisk förening och / eller inflammatoriska stimuli endast 48 timmar efter hjärnisolering. Var och en av dessa tre aspekter gör det nuvarande protokollet relevant och snabbt. Först och främst möjliggör användningen av pediatrisk mikroglia att erhålla dynamiska och reaktiva livskraftiga celler i odling utan att kräva ett ytterligare demyelineringssteg som potentiellt kan modifiera mikroglial reaktivitet in vitro. Detta protokoll syftar till att komma så nära den fysiologiska miljön i microglia som möjligt. Faktum är att microglia aldrig stöter på serum, och detta protokoll kräver inte heller användning av serum. Dessutom hindrar exponering av mikroglia så tidigt som 48 timmar efter odling dem från att förlora sina fysiologiska förmågor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Microglia, som hjärnboende makrofager, är grundläggande för flera funktioner, inklusive svar på miljöstress och hjärnhomeostas. Microglia kan anta ett stort spektrum av aktiveringsfenotyper. Dessutom är microglia som stöder proinflammatorisk fenotyp associerad med både neurodevelopmental och neurodegenerativa störningar. In vitro- studier används ofta i forskning för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier i specifika celltyper. I detta sammanhang är det mer relevant att studera mikroglial aktivering och neuroinflammation in vitro med hjälp av primära mikroglialkulturer än mikrogliala cellinjer eller stamcellsbaserade mikroglia. Användningen av vissa primära kulturer kan dock drabbas av brist på reproducerbarhet. Detta protokoll föreslår en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda valpar. Mikroglial aktivering med användning av flera stimuli efter 4 h och 24 h genom mRNA-uttryckskvantifiering och en Cy3-pärlfagocytisk analys demonstreras här. Det aktuella arbetet förväntas ge en lätt reproducerbar teknik för att isolera fysiologiskt relevant mikroglia från juvenila utvecklingsstadier.

Microglia är den CNS-bosatta makrofagen som aktiveras när den utsätts för miljöutmaningar (trauma, giftiga molekyler, inflammation) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia används ofta för att utvärdera cellautonoma mekanismer relaterade till dessa miljöutmaningar och karakterisera aktiveringstillstånd efter farmakologisk eller geneti...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Primära mikrogliakulturer används ofta för att utvärdera nya antiinflammatoriska molekyler. Detta protokoll beskriver en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda ungar.

Magnetisk isolering av mikrogliaceller från nyfödd mus för primära cellkulturer

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Detta protokoll tillåter oss att odla mikroglia under förhållanden som nära efterliknar in vivo-egenskaperna. Med hjälp av magnetisk cellsorteringsteknik tillåter vårt protokoll oss att stimulera mikroglia bara två dagar in vitro, utan att använda något serum i odlingsmediet. För att börja, använd en liten sax för att skära huden från nacken till näsan, efter sagittal sutur på 15 till 20 millimeter.Sätt in spetsarna med foramen magnum parallellt med skallen. Klipp från varje sida till ögonen. Skär mellan ögonen med en liten sax för att lossa skallen och hjärnan från huvudet.Med två pincett, ta tag i skallen nära luktlökarna och riv försiktigt skallen. Ta bort lillhjärnan och olfaktiv glödlampa med ett rakblad och skär hjärnan i två delar. Placera hjärnbitarna i en petriskål som innehåller 40 ml HBSS utan kalcium och magnesium.Förbered dissociationsblandningen enligt denna tabell. Överför 12 hjärnstycken till ett C-rör för en totalvikt på 1,2 gram per dissociationsrör. Placera sedan C-rör på dissociateren med uppvärmning.Starta det optimerade NTDK-programmet i dissociateren. Centrifugera i 20 sekunder. Slutför den mekaniska dissociationen genom pipettering tre gånger.Överför cellerna till fyra 15-millilitersrör med fästa silar. Skölj silarna med 10 ml HBSS med kalcium och magnesium. Centrifugera i 10 minuter och ta bort supernatanten med en 10-milliliters pipett.Tillsätt försiktigt 10 ml HBSS med kalcium och magnesium och suspendera pelleten igen. Återigen, centrifugera och ta bort supernatanten. Återupphäng pelleten med sex milliliter sorteringsbuffert.Upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten. Tillsätt sedan 200 mikroliter CD11b mikrob-mikrob-lösning och inkubera rören i 15 till 20 minuter vid fyra grader Celsius. Efter inkubation, suspendera pelleten igen med sex milliliter sorteringsbuffert.Upprepa centrifugeringen och suspendera pelleten igen med åtta ml sorteringsbuffert. Följ sedan Possel-programmet på separatorn för att förbereda åtta kolumner. För cellerna genom kolonnen genom att tillsätta en milliliter cellsuspension åt gången.Med en milliliter sorteringsbuffert, eluera CD11b-positiva celler på en steril elueringsplatta. Samla cellerna i ett 50-milliliter rör. Centrifugera och suspendera pelleten igen med 10 ml kallt mikrogliamedium.Räkna de CD11b-positiva cellerna. Återsuspendera cellerna i kallt mikrogliamedium för att få en slutlig koncentration av 650 000 till 700 000 celler per milliliter. Dispensera suspensionen i cellodlingsplattor.Inkubera plattorna över natten vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Nästa dag, byt ut mediet med förvärmt mikrogliamedium och upprepa inkubationen över natten. Stimulera cellerna före detta steg och utför fagocytisk analys under de senaste tre timmarna av stimuleringen.Beräkna antalet pärlor enligt denna tabell i ett förhållande av 50 pärlor per cell. Förbered pärlblandningen. Inkubera röret i en timme i ett vattenbad vid 37 grader Celsius.Vortex var 10: e minut. Till varje brunn, tillsätt den beräknade volymen av pärllösningen och inkubera i tre timmar. Med hjälp av detta tillvägagångssätt utvärderades den fagocytiska aktiviteten hos microglia efter stimulering av proinflammatoriska faktorer, såsom interleukin-1 beta, plus interferon gamma eller lipopolysackarider.Efter stimulering i sex till 24 timmar analyserades fluorescerande Cy3-mikrogliapärlor med konfokalmikroskop. Efter sex timmar börjar microglia fagocyt Cy3-pärlor endast under interleukin-1 beta plus interferon gamma-tillstånd. Efter 24 timmar var det en ökning av Cy3-fluorescens för båda typerna av stimulering, vilket belyser ökad fagocytisk aktivitet.Renheten hos mikroglialkulturen förhöjdes genom flödescytometri, vilket visade en ökning av cellviabiliteten efter sortering. Med hjälp av flödescytometri och RT-qPCR-cellpopulationsmarkörer analyserades före och efter sortering av CD11b-positiva celler från mösshjärnor vid postnatal dag åtta. Dessa analyser särskiljde olika hjärncellspopulationer, såsom CX3CR135 för microglia, O4 eller OLIG2 för oligodendrocyter, NeuN eller synaptofysin, för neuroner och ACSA-2 eller GFAP för astrocyter.Efter cellsortering med användning av CD11b-antikropp erhölls endast mikroglia. Det är viktigt att pipettera mycket försiktigt medan du lägger till suspensionen i kolonnen för att förhindra igensättning och undvika mekanisk celldöd. Efter denna metod kan transkriptomisk proteomik, såsom västerländskt blod eller Luminex, och till och med immunkemi utföras för att se effekten av mikroglial stimulering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Flera-mus neuroanatomiska Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primär Murina Brain mikrovaskulära endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Snabb och Raffinerad CD11b Magnetic Isolering av primär mikroglia med förbättrad renhet och mångsidighet

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolering av musens primära mikroglia genom magnetisk aktiverad cellsortering i djurmodeller av demyelinering

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...