Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

该研究由德国研究协会SFB 914（HI-A/SM，项目Z01）资助。我们感谢Susanne Stutte博士阅读手稿。

这项研究得到了巴伐利亚动物护理和使用委员会的批准（由道德规范批准：ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99）;这些实验严格按照德国动物立法指南进行。
1. 动物和股动脉结扎术
注意：为了诱导无菌炎症和动脉生成，使用8-10周龄雄性C57BL / 6J小鼠。在FAL或假手术期间或之后，没有一只小鼠死亡或遭受伤口感染或伤口愈合障碍。
<ol><li>麻醉 注意：在注射MMF混合麻?...

<ol>
	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

所描述的白细胞募集的多光子 体内 分析方法代表了白细胞募集研究常用工具的补充，例如（免疫）组织学或FACS分析。使用这种成像方法，可以更详细地可视化动脉生成过程中白细胞粘附和外渗的动态过程10。尽管这种方法具有附加值，但所提供的协议包括一些关键步骤和限制。有关更多故障排除提示，请参阅 表 1 。在切除侧支动脉上的浅表肌层期间，这些?...

尽管近年来对研究兴趣浓厚，但心血管疾病，如缺血性心脏病和中风，仍然是全球主要死因1。目前这些疾病的治疗方法是高侵入性疗法，例如经皮腔内血管成形术、经皮腔内冠状动脉成形术或搭桥手术2。因此，迫切需要开发替代的、非侵入性的治疗方案。身体可以在狭窄或闭塞的血管周围建立自然旁路，将中断的血流重定向到狭窄的远端。这个过程称为动脉生成2。最近的许多研究表明，增加的流体剪切会影响白细胞募集，这在动脉生成过程中起着重要作用3。目前分析动脉生成过程中白细胞募集的主要选择是 离体 （免疫）组织学分析或荧光激活细胞分选（FACS）方法4。为了能够评估动脉生成过程中的白细胞动力学，本文提出了一种使用多光子显微镜的活体成像方案。
白细胞是动脉生成过程中募集的主要血细胞3。该协议使用多光子成像来显示侧支动脉中用注射的抗CD45-PE抗体标记的贴壁白细胞的爬行，在通过股动脉结扎术（FAL）诱导动脉生成24小时后使用小鼠后肢缺血模型5，6。或者，免疫细胞可以被标记在离体并小心地注射到小鼠体内，如使用活体显微镜的血管生成研究所示7。血管和动脉内的血流可以通过CD41-FITC（标记血小板），葡聚糖-FITC（血浆）或通过二次谐波产生（SHG）可视化，后者可视化存在于维管树某些部分的基底膜中的1型胶原蛋白。SHG是多光子激发的独特自由标记效应。多光子成像允许长期细胞跟踪，而不会伤害组织并通过激光功率激发激活细胞。多光子显微镜是可视化活体动物中荧光标记细胞和结构的首选成像方法，因为它能够以最小的光毒性将荧光团激发到组织/器官更深处8。
使用在飞秒间隔内传输脉冲的调谐红外激光器仅在焦平面上激发荧光染料，在焦平面上方和下方没有激发8。因此，多光子显微镜允许高时空分辨率，更少的光损伤，并增加组织渗透成像，以研究器官内的动态生物事件。它是活体动物成像的理想显微镜工具。然而，多光子和任何其他活体显微镜技术由于心跳、呼吸、蠕动运动、肌肉张力和其他生理功能而受到组织运动的限制，这会干扰成像采集和分析。由于这些移动会损害时间和空间分辨率，有时甚至禁止后续分析，因此必须适当处理它们，以便能够进行准确的数据分析和解释。已经开发了几种策略来降低或防止组织运动引起的伪影。该协议应用称为VivoFollow9的原位漂移校正软件来校正图像采集过程中的组织漂移。这种方法提供了所需的图像稳定，可实现长期成像和细胞跟踪分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

动脉生成在很大程度上取决于白细胞和血小板募集到生长中的侧支血管的血管周围空间。在动脉生成中分析侧支动脉和白细胞的标准方法是 离体 （免疫）组织学方法。然而，这种技术不允许测量动态过程，如血流、剪切应力、细胞间相互作用和粒子速度。本文提出了一种利用活体成像监测动脉生成过程中生长侧支动脉 体内过程的方案 。这里描述的方法是一种可靠的动力学测量工具，并通过多光子激发显微镜提供具有最小光细胞毒性的高对比度分析。在分析生长的侧支动脉之前，通过股动脉的单侧结扎在小鼠的内收肌中诱导动脉生成。
结扎后，由于剪切应力增加，先前存在的侧支动脉开始生长。手术后24小时，切除侧支动脉上方的皮肤和皮下脂肪，构建一个用于进一步分析的口袋。为了在体内成像过程中可视化血流和免疫细胞，通过放置在小鼠尾静脉中的导管静脉注射CD41-异硫氰酸荧光素（FITC）（血小板）和CD45-藻红蛋白（PE）（白细胞）抗体。本文介绍了活体多光子成像作为常用的静态离体（免疫）组织学分析的替代或体内补充，以研究与动脉生成相关的过程。综上所述，本文描述了一种新颖而动态的体内方法，用于研究动脉生成的后肢模型中的免疫细胞运输、血流和剪切应力，这显着增强了评估的可能性。

多光子显微镜为白细胞跟踪提供了高时空分辨率，其中可以跟踪和监测细胞迁移步骤和速度（图4A，B）。然而，样品的生理运动带来了挑战，特别是对于长期活体显微镜图像采集。因此，良好的组织制剂和固定组织和工具的支架，例如组织漂移的实时成像校正，对于成功和稳定的成像采集是必需的。在这里，使用实时漂移工具VivoFollow来校正长期成像采集过程中?...

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Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的基本组成部分。多光子显微镜是一种有效的工具，用于跟踪体内 高 时空分辨率和较少光毒性的细胞动力学，以研究动脉生成过程中的白细胞募集和外渗。

多光子活体成像用于监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中白细胞募集

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

我们的协议允许研究人员通过实时跟踪生长中的侧支动脉中的免疫细胞粘附和外渗来分析体内动脉生成过程。多光子显微镜技术允许以低光毒性和高时空分辨率可视化活小鼠模型深层组织中的细胞动力学。显微镜程序将由Helen Ishikawa-Ankerhold博士实验室多光子成像平台的技术助理Dominic van den Heuvel演示。我将演示外科手术。首先，将麻醉的小鼠置于仰卧位。然后将两块模制粘土放在小鼠的上后肢下，以确保内收肌的平面位置。将鼠标放在体视显微镜下。去除双腿的毛发后，在右后肢早期股动脉结扎的疤痕周围消毒并切开皮肤。从腿部顶部去除皮肤和脂肪层，并使用缝合线拉开剩余的皮肤，在内收肌周围与侧支血管形成一个口袋。接下来，去除皮下脂肪，以清楚地看到内收肌、深动脉和静脉以及侧支血管。使用细镊子去除侧支血管顶部的浅表肌肉层。用生理盐水填充准备好的口袋以防止组织干燥，并对假手术的左后肢继续相同的程序。在成像之前，在两个口袋中添加超声凝胶，以防止干燥，并用作与物镜光学耦合的浸没介质。打开钛蓝宝石激光盒、电子接口盒、培养箱加热单元、荧光灯和计算机的钥匙。启动采集软件。将波长设置为800纳米并打开显微镜快门。在测量向导对话框中，选择仪器模式为单光束，选择测量模式为3D扫描延时摄影。然后将麻醉小鼠转移到显微镜的预热培养室中，并将超声凝胶直接与物镜前透镜接触的区域定位。打开落射荧光显微镜快门。然后为富时可视化选择适当的过滤器或二向色性设置。通过在落射荧光照明下跟踪血流来定义感兴趣的区域。将感兴趣区域带入中心视野后，关闭落射荧光显微镜快门。在XY扫描仪对话框中，设置图像大小、像素、频率、线平均值所需的参数。调整激光功率并设置绿色、红色和蓝色通道的光电倍增管增益。为活体成像和漂移校正设置选择合适的物镜。通过按下测量向导对话框窗口中的红色按钮启动预览采集模式来定义图像堆栈范围。要获得良好的图像，请通过聚焦来定义感兴趣的区域和结构。观察屏幕时，通过移动物镜直到图像消失并将其设置为零来改变焦点。将目标位置设置为轴向上的最后一个位置。然后通过向下移动物镜来改变相反方向的焦点，直到图像再次从屏幕上消失。单击测量向导对话框左上角的停止按钮，并将步长设置为两微米。在测量向导对话框中选择 python 轴作为第一个轴设备，然后选择不激活自动保存模式。然后仅在时间轴上选中自动保存框。接下来，按可用设备窗口中的 Python 图标以打开 Python 对话框窗口。在 Python 对话框轴设置中，输入“从”和“到”部分，然后输入步数。转到XYZ载物台Z对话窗口，将两端的扫描范围扩大200微米。为此，请在开始输入 200 微米，在末尾输入负 240 微米，范围将自动设置为负 440 微米。打开 VivoFollow 前端对话框。通过按测量向导对话框左上角的绿色箭头开始图像采集。如果使用实时漂移校正，请查找要显示的漂移校正配置的对话框。然后设置在移动地标参考中使用的采集通道。输入添加到第一个和最后一个 Z 位置的最大校正偏移（以微米为单位），然后单击“确定”。在体内流前端对话窗口中实时监测图像采集过程中X、Y和Z的电流漂移偏移，并在需要另一个麻醉重新注射周期时在35分钟后停止成像采集。注入半剂量的MMF混合物并重新开始成像采集，直到实验完成。该工具允许长期图像采集，实现高质量的数据收集，适用于跟踪细胞以进行速度测量。如未进行漂移校正时所示，感兴趣区域会逐渐偏离记录视图，从而影响跟踪细胞以进行速度分析的能力。但是，可以使用漂移校正软件记录稳定的动画，并且可以长时间跟踪更多的细胞。漂移校正软件还可以提供系统校正的 X、Y 和 Z 偏移随时间变化的可视化。多光子显微镜为白细胞跟踪提供了高时空分辨率，其中可以跟踪和监测细胞迁移步骤和速度。通过准备用于多光子成像的侧支血管，必须避免对侧支动脉的损伤。在影像学检查之前，安全识别正确的侧支动脉非常重要。通过这种侧支动脉活体多光子成像的新程序，可以通过改变抗体标记来分析体内所有血细胞的粘附和外渗。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

颈动脉支架植入再狭窄的研究的小鼠模型

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

科研

医学

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原位胶质母细胞瘤小鼠模型的维护脑实质的物理约束，并适用于活体双光子显微镜

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

顺序<em&gt;在体内</em&gt;成骨干/祖细胞在骨折修复的影像学

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

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在皮下肿瘤模型的评估肿瘤浸润白细胞亚群

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Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

对急性和亚急性鼠下肢缺血的方法

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

小鼠后肢联合活体显微镜和超声造影研究胰岛素诱导的血管舒张和肌肉灌注

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

在鼠耳皮肤的免疫反应的活体多光子成像诱导缺血再灌注损伤

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

通过轻型显微镜对小鼠急性心肌炎模型中白细胞浸润的定量可视化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

小鼠外周动脉疾病模型中单核细胞归巢和肿瘤相关血管生成的活体显微镜观察

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

评估下肢缺血的Murine模型的治疗血管生成

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...