Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

De studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, project Z01). Wij danken Dr. Susanne Stutte voor het lezen van het manuscript.

Deze studie werd goedgekeurd door de Beierse Animal Care and Use Committee (goedgekeurd door ethische code: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); deze experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Duitse richtlijnen van de dierwetgeving.
1. Dieren en femorale arterieligatie (FAL)
OPMERKING: Om steriele ontsteking en arteriogenese te induceren, werden 8-10 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen gebruikt. Geen van de muizen stierf of leed aan een wondinfec...

<ol>
	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

De beschreven methode van multifoton in vivo analyse van leukocytenrekrutering vormt een aanvulling op veelgebruikte hulpmiddelen voor leukocytenrekruteringsstudies zoals (immuno-) histologische of FACS-analyses. Met deze beeldvormingsmethode is het mogelijk om de dynamische processen in leukocytenaanhechting en extravasatie tijdens arteriogenese in meer detail te visualiseren10. Ondanks de toegevoegde waarde van deze methode, bevat het aangeboden protocol enkele kritieke stappen en beper...

Ondanks intensieve onderzoeksinteresse in de afgelopen jaren, zijn hart- en vaatziekten, bijvoorbeeld ischemische hartziekten en beroertes, nog steeds de belangrijkste wereldwijde doodsoorzaak1. Huidige behandelingen voor deze ziekten zijn zeer invasieve therapieën zoals percutane transluminale angioplastiek, percutane transluminale coronaire angioplastiek of bypass-chirurgie2. Daarom is de ontwikkeling van alternatieve, niet-invasieve therapeutische opties dringend nodig. Het lichaam kan natuurlijke bypasses rond een gestenoseerd of afgesloten vat creëren om de onderbroken bloedtoevoer naar het distale deel van de stenose om te leiden. Dit proces wordt arteriogenese2 genoemd. Veel recente studies hebben aangetoond dat verhoogde vloeistofafschuiving invloed heeft op de rekrutering van leukocyten, die een belangrijke rol speelt tijdens arteriogenese3. De belangrijkste huidige opties om de rekrutering van leukocyten tijdens arteriogenese te analyseren zijn ex vivo (immuno-) histologische analyses of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie4. Om de beoordeling van leukocytendynamiek tijdens arteriogenese mogelijk te maken, presenteert dit artikel een intravitaal beeldvormingsprotocol met multifotonenmicroscopie.
Leukocyten zijn de belangrijkste bloedcellen die worden gerekruteerd tijdens het proces van arteriogenese3. Dit protocol maakt gebruik van multifotonenbeeldvorming om het kruipen van adherente leukocyten gelabeld met geïnjecteerde anti-CD45-PE-antilichamen in collaterale slagaders aan te tonen, 24 uur na de inductie van arteriogenese door femorale arterieligatie (FAL) met behulp van een muizenachtermaat ischemiemodel 5,6. Als alternatief kunnen immuuncellen ex vivo worden gelabeld en zorgvuldig in muizen worden geïnjecteerd, zoals blijkt uit onderzoeken naar angiogenese met behulp van intravitale microscopie7. De bloedstroom in bloedvaten en slagaders kan worden gevisualiseerd door CD41-FITC (om bloedplaatjes te labelen), dextran-FITC (plasma) of door de tweede harmonische generatie (SHG), die collageen type 1 visualiseert dat aanwezig is in het keldermembraan van een deel van de vaatboom. SHG is een uniek gratis labelend effect van de multifoton excitatie. Multifotonbeeldvorming maakt langdurige celtracking mogelijk zonder het weefsel te beschadigen en de cellen te activeren door laservermogensexcitatie. Multifotonenmicroscopie is de beeldvormingsmethode bij uitstek voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde cellen en structuren in levende dieren vanwege het vermogen om de fluoroforen dieper in het weefsel / organen te exciteren met minimale fototoxiciteit8.
Het gebruik van afgestemde infraroodlasers met pulsen die binnen femtoseconde-intervallen worden afgeleverd, prikkelt het fluorochroom alleen bij het brandpuntsvlak, zonder excitatie boven en onder het brandpuntsvlak8. Multifotonenmicroscopie maakt dus een hoge spatio-temporele resolutie, minder fotoschade en verhoogde weefselpenetratiebeeldvorming mogelijk voor het bestuderen van dynamische biologische gebeurtenissen in de organen. Het is een ideaal microscopie-instrument voor beeldvorming van levende dieren. Multifoton en elke andere kunst van intravitale microscopie wordt echter beperkt door weefselbeweging als gevolg van hartslag, ademhaling, peristaltische bewegingen, spiertonaliteit en andere fysiologische functies, die de verwerving en analyse van beeldvorming verstoren. Aangezien deze bewegingen de temporele en ruimtelijke resolutie aantasten en soms zelfs latere analyse verbieden, moeten ze op de juiste manier worden aangepakt om nauwkeurige gegevensanalyse en -interpretatie mogelijk te maken. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om artefacten van weefselbeweging te verlagen of te voorkomen. Dit protocol past een in situ driftcorrectiesoftware genaamd VivoFollow9 toe om weefseldrift tijdens beeldacquisitie te corrigeren. Deze aanpak biedt de vereiste beeldstabilisatie, waardoor beeldvorming op lange termijn en celtraceringsanalyse mogelijk zijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

Arteriogenese is sterk afhankelijk van leukocyten- en bloedplaatjesrekrutering naar de perivasculaire ruimte van groeiende collaterale vaten. De standaardbenadering voor het analyseren van collaterale slagaders en leukocyten in arteriogenese is ex vivo (immuno-) histologische methodologie. Deze techniek maakt het echter niet mogelijk om dynamische processen zoals bloedstroom, schuifspanning, cel-celinteracties en deeltjessnelheid te meten. Dit artikel presenteert een protocol om in vivo processen in groeiende collaterale slagaders tijdens arteriogenese te monitoren met behulp van intravitale beeldvorming. De hier beschreven methode is een betrouwbaar hulpmiddel voor dynamische meting en biedt een analyse met hoog contrast met minimale fotocytotoxiciteit, geleverd door multifoton excitatiemicroscopie. Voorafgaand aan het analyseren van groeiende collaterale slagaders, werd arteriogenese geïnduceerd in de adductorspier van muizen door unilaterale ligatie van de dijbeenslagader.
Na de ligatie begonnen de reeds bestaande collaterale slagaders te groeien als gevolg van verhoogde schuifspanning. Vierentwintig uur na de operatie werden de huid en het onderhuidse vet boven de collaterale slagaders verwijderd, waardoor een zak werd geconstrueerd voor verdere analyses. Om de bloedstroom en immuuncellen tijdens in vivo beeldvorming te visualiseren, werden CD41-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (bloedplaatjes) en CD45-fycoerythrine (PE) (leukocyten) antilichamen intraveneus (i.v.) geïnjecteerd via een katheter die in de staartader van een muis werd geplaatst. Dit artikel introduceert intravitale multifotonenbeeldvorming als alternatief of in vivo complementatie voor de veelgebruikte statische ex vivo (immuno-) histologische analyses om processen te bestuderen die relevant zijn voor arteriogenese. Samenvattend beschrijft dit artikel een nieuwe en dynamische in vivo methode om immuuncelhandel, bloedstroom en schuifspanning te onderzoeken in een achterledigmodel van arteriogenese, wat de evaluatiemogelijkheden aanzienlijk verbetert.

Multifotonenmicroscopie biedt een hoge spatio-temporele resolutie voor het volgen van leukocyten, waarbij celmigratiestappen en -snelheid kunnen worden gevolgd en gecontroleerd (figuur 4A, B). De fysiologische beweging van het monster vormt echter een uitdaging, vooral voor langdurige intravitale microscopie-beeldacquisities. Daarom zijn een goed weefselpreparaat en houders om het weefsel te fixeren en hulpmiddelen, zoals real-time beeldcorrectie voor weefseldrift, vereist v...

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het proces van arteriogenese in vivo te analyseren door de hechting en extravasatie van immuuncellen in groeiende collaterale slagaders in realtime te volgen. De multifotonenmicroscopietechniek maakt de visualisatie mogelijk van celdynamica in het diepe weefsel van levende muismodellen met lage fototoxiciteit en met een hoge spatiotemporale resolutie. De microscoopprocedure wordt gedemonstreerd door Dominic van den Heuvel, een technisch assistent van het multifoton imaging platform uit het laboratorium van Dr.Helen Ishikawa-Ankerhold.Ik zal de chirurgische procedure demonstreren. Plaats om te beginnen de verdoofde muis in rugligging. Plaats vervolgens twee stukken gegoten klei onder de bovenste achterpoot van de muis om een vlakke positie van de adductorenpier te garanderen.Plaats de muis onder de stereomicroscoop. Na het verwijderen van het haar van beide benen, desinfecteer en knip de huid in een cirkel rond het litteken van de eerdere femorale slagaderligatie van de rechter achterpoot. Verwijder de huid en vetlaag van de bovenkant van het been en trek de resterende huid opzij met behulp van hechtingen om een zak rond de adductorspier te creëren met de collaterale vaten.Verwijder vervolgens het onderhuidse vet om een duidelijk zicht te krijgen op de adductorenspier, de profunda-slagader en ader, evenals de collaterale bloedvaten. Verwijder de oppervlakkige spierlaag bovenop de collaterale vaten met een fijne tang. Vul de voorbereide zak met zoutoplossing om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt en ga door met dezelfde procedure voor de schijnoperatie linkerachterpoot.Voeg voor het fotograferen ultrasone gel toe in beide zakken die uitdroging voorkomt en dient als een onderdompelingsmedium voor optische koppeling met het objectief. Schakel de sleutel van de titanium saffierlaserdoos, de elektronische interfacebox, de verwarmingseenheid van de incubatorkamer, de fluorescentielamp en de computer in. Start de acquisitiesoftware.Stel de golflengte in op 800 nanometer en open de sluiter van de microscoop. Kies in het dialoogvenster van de meetwizard de instrumentmodus als enkele bundel en de meetmodus als time-lapse voor 3D-scans. Breng vervolgens de verdoofde muis over in de voorverwarmde incubatiekamer van de microscoop en plaats het gebied met de ultrasone gel direct in contact met de objectieve frontlens.Open de sluiter van de epifluorescentiemicroscoop. Kies vervolgens een geschikte filter- of dichroïsche instelling voor FTSE-visualisatie. Definieer het interessegebied door de bloedstroom te volgen onder epifluorescentieverlichting.Nadat u het interessegebied in het middelste gezichtsveld hebt gebracht, sluit u de epifluorescentiemicroscoopsluiter. Stel in het dialoogvenster XY-scanner de vereiste parameters in voor afbeeldingsgrootte, pixel, frequentie en lijngemiddelde. Pas het laservermogen aan en stel de versterking van de fotovermenigvuldigingsfactor in voor de kanalen groen, rood en blauw.Selecteer een adequaat objectief voor instellingen voor intravitale beeldvorming en driftcorrectie. Definieer het afbeeldingsstapelbereik door de voorbeeldacquisitiemodus te starten door op de rode knop in het dialoogvenster van de metingswizard te drukken. Om goede beelden te verkrijgen, definieert u het gebied en de structuur van belang door scherp te stellen.Terwijl u het scherm observeert, wijzigt u de focus door het objectief te verplaatsen totdat de afbeelding verdwijnt en stelt u deze in op nul. Stel de objectieve positie in als de laatste positie in de axiale richting. Verander vervolgens de focus in de tegenovergestelde richting door het objectief naar beneden te verplaatsen totdat het beeld weer van het scherm verdwijnt.Klik op de stopknop in de linkerbovenhoek van het dialoogvenster van de meetwizard en stel de stapgrootte in op twee micrometer. Kies de python-as als het eerste asapparaat in het dialoogvenster van de meetwizard en selecteer de modus voor automatisch opslaan niet activeren. Vink vervolgens het vakje voor automatisch opslaan alleen op de tijdas aan.Druk vervolgens op het Python-pictogram in het venster met beschikbare apparaten om het dialoogvenster Python te openen. Voer in de asinstellingen van het dialoogvenster Python de secties van en naar in en voer vervolgens het aantal stappen in. Ga naar het dialoogvenster XYZ fase Z en vergroot het scanbereik aan beide uiteinden met 200 micrometer.Om dit te doen, voert u 200 micrometer in start in en voert u min 240 micrometer in end in en het bereik wordt automatisch ingesteld als minus 440 micrometer. Open het Front-end dialoogvenster van VivoFollow. Start de beeldacquisitie door op de groene pijlpunt in de linkerbovenhoek van het dialoogvenster van de meetwizard te drukken.Als live driftcorrectie wordt gebruikt, zoekt u naar een dialoogvenster waarin de driftcorrectieconfiguratie wordt weergegeven. Stel vervolgens het acquisitiekanaal in dat wordt gebruikt als in een mobiele oriëntatiepuntreferentie. Voer de maximale correctieverschuiving in micrometers in die zijn toegevoegd aan de eerste en laatste Z-positie en klik op OK. Bewaak de huidige driftverschuiving in X, Y en Z in realtime tijdens de beeldacquisitie in het front-end dialoogvenster vivo flow en stop de beeldacquisitie na 35 minuten wanneer een nieuwe cyclus van herinjectie van anesthesie vereist is.Injecteer een halve dosis van de MMF-mix en start de beeldvormingsacquisitie opnieuw totdat het experiment is voltooid. Deze tool maakt langdurige beeldacquisitie mogelijk, maakt hoogwaardige gegevensverzameling mogelijk en is geschikt voor het volgen van de cellen voor snelheidsmetingen. Zoals getoond zonder driftcorrectie, drijft het interessegebied geleidelijk weg van de opnameweergave, wat van invloed is op de mogelijkheid om cellen te volgen voor snelheidsanalyse.Stabiele films kunnen echter worden opgenomen met de driftcorrectiesoftware en meer cellen kunnen over een lange periode worden gevolgd. De driftcorrectiesoftware kan ook een visualisatie bieden van de X-, Y- en Z-offsets in de loop van de tijd die door het systeem is gecorrigeerd. Multifotonenmicroscopie biedt een hoge spatiotemporale resolutie voor het volgen van leukocyten, waarbij celmigratiestappen en -snelheid kunnen worden gevolgd en bewaakt.Door de collaterale vaten voor te bereiden op multifotonenbeeldvorming, is het essentieel om schade aan de collaterale slagaders te voorkomen. Voor beeldvorming is het belangrijk om veilig de juiste collaterale slagader te identificeren. Met deze nieuwe procedure van intravitale multifotonenbeeldvorming van de collaterale slagaders is het mogelijk om de hechting en extravasatie van alle bloedcellen in vivo te analyseren door het antilichaamlabel te wijzigen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Een Muizenmodel van Stent Implantatie in de halsslagader voor de Studie van Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Methoden voor acute en subacute muizen achterbeen ischemie

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Gecombineerde Intravital microscopie en Contrast-enhanced Ultrasonografie van het stuk van de muis om te bestuderen van de insuline-geïnduceerde vasodilatatie en spier perfusie

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...