Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

L’étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projet Z01). Nous remercions la Dre Susanne Stutte d’avoir lu le manuscrit.

Cette étude a été approuvée par le Comité bavarois de soin et d’utilisation des animaux (approuvé par le code d’éthique : ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99) ; ces expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les directives de la législation animale allemande.
1. Animaux et ligature de l’artère fémorale (LAF)
REMARQUE: Pour induire une inflammation stérile et l’artériogenèse, des souris C57BL / 6J mâles âgées de 8 à 10 semaines on...

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	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

La méthode décrite d’analyse multiphotonique in vivo du recrutement leucocytaire représente un complément aux outils couramment utilisés pour les études de recrutement leucocytaire telles que les analyses (immuno-) histologiques ou FACS. Avec cette méthode d’imagerie, il est possible de visualiser plus en détail les processus dynamiques d’adhérence et d’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse10. Malgré la valeur ajoutée de cette méthode, le protoco...

Malgré l’intérêt intensif de la recherche au cours des dernières années, les maladies cardiovasculaires, par exemple les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux, demeurent la principale cause mondiale de décès1. Les traitements actuels de ces maladies sont des thérapies hautement invasives telles que l’angioplastie transluminale percutanée, l’angioplastie coronaire transluminale percutanée ou le pontagecoronarien 2. Par conséquent, le développement d’options thérapeutiques alternatives et non invasives est nécessaire de toute urgence. Le corps peut créer des pontages naturels autour d’un vaisseau sténosé ou obstrué pour rediriger le flux sanguin interrompu vers la partie distale de la sténose. Ce processus est appelé artériogenèse2. De nombreuses études récentes ont montré que l’augmentation du cisaillement des fluides a un impact sur le recrutement des leucocytes, qui joue un rôle important lors de l’artériogenèse3. Les principales options actuelles pour analyser le recrutement des leucocytes au cours de l’artériogenèse sont les analyses histologiques ex vivo ou la méthodologie de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)4. Pour permettre l’évaluation de la dynamique des leucocytes au cours de l’artériogenèse, cet article présente un protocole d’imagerie intravitale avec microscopie multiphotonique.
Les leucocytes sont les principales cellules sanguines recrutées au cours du processus d’artériogenèse3. Ce protocole utilise l’imagerie multiphotonique pour montrer le rampement des leucocytes adhérents marqués avec des anticorps anti-CD45-PE injectés dans les artères collatérales, 24 h après l’induction de l’artériogenèse par ligature de l’artère fémorale (LAF) utilisant une ischémie des membres postérieurs murins modèle 5,6. Alternativement, les cellules immunitaires peuvent être marquées ex vivo et soigneusement injectées à la souris, comme le montrent les études sur l’angiogenèse utilisant la microscopie intravitale7. Le flux sanguin à l’intérieur des vaisseaux et des artères peut être visualisé par CD41-FITC (pour marquer les plaquettes), dextran-FITC (plasma), ou par la deuxième génération harmonique (SHG), qui visualise le collagène de type 1 présent dans la membrane basale d’une partie de l’arbre vasculaire. SHG est un effet d’étiquetage libre unique de l’excitation multiphotonique. L’imagerie multiphotonique permet un suivi cellulaire à long terme sans endommager le tissu et activer les cellules par excitation de puissance laser. La microscopie multiphotonique est la méthode d’imagerie de choix pour visualiser les cellules et les structures marquées par fluorescence chez les animaux vivants en raison de sa capacité à exciter les fluorophores plus profondément dans les tissus / organes avec une phototoxicité minimale8.
L’utilisation de lasers infrarouges accordés avec des impulsions délivrées à intervalles femtosecondes excite le fluorochrome uniquement au plan focal, sans excitation au-dessus et au-dessous du plan focal8. Ainsi, la microscopie multiphotonique permet une résolution spatio-temporelle élevée, moins de photo-dommages et une imagerie de pénétration tissulaire accrue pour étudier les événements biologiques dynamiques à l’intérieur des organes. C’est un outil de microscopie idéal pour l’imagerie d’animaux vivants. Cependant, le multiphoton et tout autre art de la microscopie intravitale est limité par le mouvement des tissus dû au rythme cardiaque, à la respiration, aux mouvements péristaltiques, à la tonalité musculaire et à d’autres fonctions physiologiques, ce qui perturbe l’acquisition et l’analyse de l’imagerie. Comme ces mouvements nuisent à la résolution temporelle et spatiale et parfois même à l’analyse ultérieure, ils doivent être traités de manière appropriée pour permettre une analyse et une interprétation précises des données. Plusieurs stratégies ont été développées pour réduire ou prévenir les artefacts du mouvement des tissus. Ce protocole applique un logiciel de correction de la dérive in situ appelé VivoFollow9 pour corriger la dérive tissulaire lors de l’acquisition d’images. Cette approche fournit la stabilisation d’image requise, permettant l’imagerie à long terme et l’analyse du suivi cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

L’artériogenèse dépend fortement du recrutement des leucocytes et des plaquettes dans l’espace périvasculaire des vaisseaux collatéraux en croissance. L’approche standard pour l’analyse des artères collatérales et des leucocytes dans l’artériogenèse est la méthodologie histologique ex vivo . Cependant, cette technique ne permet pas de mesurer des processus dynamiques tels que le flux sanguin, la contrainte de cisaillement, les interactions cellule-cellule et la vitesse des particules. Cet article présente un protocole pour surveiller les processus in vivo dans les artères collatérales en croissance au cours de l’artériogenèse en utilisant l’imagerie intravitale. La méthode décrite ici est un outil fiable pour la mesure dynamique et offre une analyse à contraste élevé avec une photocytotoxicité minimale, fournie par microscopie d’excitation multiphotonique. Avant d’analyser les artères collatérales en croissance, l’artériogenèse a été induite dans le muscle adducteur de souris par ligature unilatérale de l’artère fémorale.
Après la ligature, les artères collatérales préexistantes ont commencé à se développer en raison de l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Vingt-quatre heures après la chirurgie, la peau et la graisse sous-cutanée au-dessus des artères collatérales ont été enlevées, construisant une poche pour d’autres analyses. Pour visualiser le flux sanguin et les cellules immunitaires pendant l’imagerie in vivo , des anticorps à base d’isothiocyanate de fluorescéine CD41 (FITC) (plaquettes) et de CD45-phycoérythrine (PE) (leucocytes) ont été injectés par voie intraveineuse (i.v.) via un cathéter placé dans la veine de la queue d’une souris. Cet article présente l’imagerie multiphotonique intravitale comme alternative ou complément in vivo aux analyses histologiques statiques ex vivo (immuno-) couramment utilisées pour étudier les processus pertinents pour l’artériogenèse. En résumé, cet article décrit une méthode in vivo nouvelle et dynamique pour étudier le trafic de cellules immunitaires, le flux sanguin et le stress de cisaillement dans un modèle d’artériogenèse des membres postérieurs, ce qui améliore considérablement les possibilités d’évaluation.

La microscopie multiphotonique offre une résolution spatio-temporelle élevée pour le suivi des leucocytes, dans laquelle les étapes et la vitesse de migration cellulaire peuvent être suivies et surveillées (Figure 4A,B). Cependant, le mouvement physiologique de l’échantillon pose un défi, en particulier pour les acquisitions d’images de microscopie intravitale à long terme. Par conséquent, une bonne préparation tissulaire et des supports pour fixer le tissu et...

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Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Notre protocole permet aux chercheurs d’analyser le processus d’artériogenèse in vivo en suivant l’adhérence et l’extravasation des cellules immunitaires dans les artères collatérales en croissance en temps réel. La technique de microscopie multiphotonique permet de visualiser la dynamique cellulaire dans les tissus profonds de modèles murins vivants à faible phototoxicité et à haute résolution spatio-temporelle. La procédure au microscope sera démontrée par Dominic van den Heuvel, assistant technique de la plate-forme d’imagerie multiphotonique du laboratoire du Dr Helen Ishikawa-Ankerhold.Je vais démontrer l’intervention chirurgicale. Pour commencer, placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal. Placez ensuite deux morceaux d’argile moulée sous le membre postérieur supérieur de la souris pour assurer une position plane du muscle adducteur.Placez la souris sous le stéréomicroscope. Après avoir enlevé les poils des deux jambes, désinfectez et coupez la peau en cercle autour de la cicatrice de la ligature antérieure de l’artère fémorale du membre postérieur droit. Retirez la couche de peau et de graisse du haut de la jambe et écartez la peau restante à l’aide de sutures pour créer une poche autour du muscle adducteur avec les vaisseaux collatéraux.Ensuite, retirez la graisse sous-cutanée pour obtenir une vision claire du muscle adducteur, de l’artère et de la veine profunda, ainsi que des vaisseaux collatéraux. Enlevez la couche musculaire superficielle sur le dessus des vaisseaux collatéraux à l’aide d’une pince fine. Remplissez la poche préparée avec une solution saline pour empêcher le tissu de sécher et continuez la même procédure pour le membre postérieur gauche opéré fictif.Avant l’imagerie, ajoutez du gel à ultrasons dans les deux poches qui empêche le séchage et sert de milieu d’immersion pour le couplage optique avec l’objectif. Allumez la clé du boîtier laser saphir en titane, le boîtier d’interfaces électroniques, l’unité de chauffage de la chambre de l’incubateur, la lampe fluorescente et l’ordinateur. Lancez le logiciel d’acquisition.Réglez la longueur d’onde sur 800 nanomètres et ouvrez l’obturateur du microscope. Dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure, choisissez le mode instrument comme faisceau unique et le mode de mesure comme timelapse de numérisation 3D. Ensuite, transférez la souris anesthésiée dans la chambre d’incubation préchauffée du microscope et positionnez la zone avec le gel à ultrasons directement en contact avec la lentille frontale de l’objectif.Ouvrez l’obturateur du microscope à épifluorescence. Choisissez ensuite un filtre ou un paramètre dichroïque adéquat pour la visualisation FTSE. Définissez la zone d’intérêt en suivant le flux sanguin sous éclairage par épifluorescence.Après avoir placé la zone d’intérêt dans le champ de vision central, fermez l’obturateur du microscope à épifluorescence. Dans la boîte de dialogue du scanner XY, définissez les paramètres requis pour la taille de l’image, le pixel, la fréquence et la moyenne des lignes. Ajustez la puissance laser et réglez le gain du multiplicateur photo pour les canaux vert, rouge et bleu.Sélectionnez un objectif adéquat pour les paramètres d’imagerie intravitale et de correction de la dérive. Définissez la plage de piles d’images en démarrant le mode d’acquisition de l’aperçu en appuyant sur le bouton rouge dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure. Pour obtenir de bonnes images, définissez la zone et la structure d’intérêt en faisant la mise au point.Tout en observant l’écran, changez de focus en déplaçant l’objectif jusqu’à ce que l’image disparaisse et réglez-le sur zéro. Définissez la position de l’objectif comme dernière position dans la direction axiale. Ensuite, changez la mise au point dans la direction opposée en déplaçant l’objectif vers le bas jusqu’à ce que l’image disparaisse à nouveau de l’écran.Cliquez sur le bouton d’arrêt dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue de l’assistant de mesure et définissez la taille du pas sur deux micromètres. Choisissez l’axe python comme périphérique du premier axe dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure et sélectionnez ne pas activer le mode d’enregistrement automatique. Cochez ensuite la case d’enregistrement automatique uniquement sur l’axe temporel.Ensuite, appuyez sur l’icône Python dans la fenêtre des périphériques disponibles pour ouvrir la boîte de dialogue Python. Dans les paramètres de l’axe de la boîte de dialogue Python, entrez les sections from et to, puis entrez le nombre d’étapes. Accédez à la fenêtre de dialogue Stade Z XYZ et agrandissez la plage de balayage de 200 micromètres aux deux extrémités.Pour ce faire, entrez 200 micromètres au début et entrez moins 240 micromètres à la fin et la plage sera automatiquement définie sur moins 440 micromètres. Ouvrez la boîte de dialogue frontale VivoFollow. Démarrez l’acquisition d’image en appuyant sur la pointe de flèche verte dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue de l’assistant de mesure.Si la correction de dérive sous tension est utilisée, recherchez une boîte de dialogue pour la configuration de correction de dérive à afficher. Définissez ensuite le canal d’acquisition utilisé comme référence de repère mobile. Entrez le décalage de correction maximal en micromètres ajouté à la première et à la dernière position Z, puis cliquez sur OK. Surveillez le décalage de dérive de courant dans X, Y et Z en temps réel pendant l’acquisition d’image dans la fenêtre de dialogue frontale du flux vivo et arrêtez l’acquisition d’imagerie après 35 minutes lorsqu’un autre cycle de réinjection d’anesthésie est nécessaire.Injectez une demi-dose du mélange MMF et recommencez l’acquisition de l’imagerie jusqu’à ce que l’expérience soit terminée. Cet outil permet l’acquisition d’images à long terme, permet la collecte de données de haute qualité et convient au suivi des cellules pour les mesures de vitesse. Comme indiqué sans correction de dérive, la région d’intérêt s’éloigne progressivement de la vue d’enregistrement, ce qui a un impact sur la capacité de suivi des cellules pour l’analyse de la vitesse.Cependant, des films stables peuvent être enregistrés avec le logiciel de correction de dérive et plus de cellules peuvent être suivies sur une longue période. Le logiciel de correction de dérive peut également fournir une visualisation des décalages X, Y et Z au fil du temps qui ont été corrigés par le système. La microscopie multiphotonique offre une résolution spatio-temporelle élevée pour le suivi des leucocytes dans laquelle les étapes et la vitesse de migration cellulaire peuvent être suivies et surveillées.En préparant les vaisseaux collatéraux pour l’imagerie multiphotonique, il est essentiel d’éviter d’endommager les artères collatérales. Avant l’imagerie, il est important d’identifier en toute sécurité la bonne artère collatérale. Avec cette nouvelle procédure d’imagerie multiphotonique intravitale des artères collatérales, il est possible d’analyser l’adhérence et l’extravasation de toutes les cellules sanguines in vivo en modifiant le marqueur des anticorps.

Research

JoVE Journal

Medicine

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