Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
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Die Studie wurde vom SFB 914 der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (HI-A/SM, Projekt Z01). Wir danken Dr. Susanne Stutte für die Lektüre des Manuskripts.

Diese Studie wurde vom Bayerischen Tierschutzausschuss genehmigt (genehmigt durch den Ethikkodex: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Diese Versuche wurden unter strikter Einhaltung der deutschen tierrechtlichen Richtlinien durchgeführt.
1. Tiere und Ligatur der Oberschenkelarterie (FAL)
HINWEIS: Um eine sterile Entzündung und Arteriogenese zu induzieren, wurden 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Keine der Mäuse starb oder litt an einer Wundinfektio...

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	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

Die beschriebene Methode der Multiphotonen-in-vivo-Analyse der Leukozytenrekrutierung stellt eine Ergänzung zu den üblicherweise verwendeten Werkzeugen für Leukozytenrekrutierungsstudien wie (immun-)histologische oder FACS-Analysen dar. Mit diesem bildgebenden Verfahren ist es möglich, die dynamischen Prozesse der Leukozytenadhärenz und -extravasation während der Arteriogenese detaillierter darzustellen10. Trotz des Mehrwerts dieser Methode enthält das angebotene Protokoll einige k...

Trotz intensivem Forschungsinteresse in den letzten Jahren sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen, z. B. ischämische Herzkrankheit und Schlaganfall, nach wie vor die weltweit häufigste Todesursache1. Gegenwärtig werden diese Erkrankungen mit hochinvasiven Therapien wie der perkutanen transluminalen Angioplastie, der perkutanen transluminalen Koronarangioplastie oder der Bypass-Operationbehandelt 2. Daher ist die Entwicklung alternativer, nicht-invasiver Therapieoptionen dringend erforderlich. Der Körper kann natürliche Bypässe um ein verstumpftes oder verschlossenes Gefäß herum anlegen, um den unterbrochenen Blutfluss in den distalen Teil der Stenose umzuleiten. Dieser Prozess wird als Arteriogenese2 bezeichnet. Viele neuere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Flüssigkeitsscherung die Rekrutierung von Leukozyten beeinflusst, die eine wichtige Rolle bei der Arteriogenesespielt 3. Die wichtigsten aktuellen Optionen zur Analyse der Rekrutierung von Leukozyten während der Arteriogenese sind ex vivo (immun-)histologische Analysen oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)4. Um die Leukozytendynamik während der Arteriogenese beurteilen zu können, wird in dieser Arbeit ein intravitales Bildgebungsprotokoll mit Multiphotonenmikroskopie vorgestellt.
Leukozyten sind die wichtigsten Blutzellen, die während des Prozesses der Arteriogenese rekrutiertwerden 3. Dieses Protokoll verwendet Multiphotonen-Bildgebung, um das Kriechen von adhärenten Leukozyten, die mit injizierten Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, in Kollateralarterien 24 h nach der Induktion der Arteriogenese durch Femoralarterienligatur (FAL) unter Verwendung eines murinen Hintergliedmaßen-Ischämiemodells zu zeigen 5,6. Alternativ können Immunzellen ex vivo markiert und Mäusen schonend injiziert werden, wie Studien zur Angiogenese mittels Intravitalmikroskopiegezeigt haben 7. Der Blutfluss in Gefäßen und Arterien kann durch CD41-FITC (zur Markierung von Blutplättchen), Dextran-FITC (Plasma) oder durch die zweite harmonische Generation (SHG) visualisiert werden, die Kollagen Typ 1 in der Basalmembran eines Teils des Gefäßbaums sichtbar macht. SHG ist ein einzigartiger freier Markierungseffekt der Multiphotonenanregung. Die Multiphotonen-Bildgebung ermöglicht eine langfristige Zellverfolgung, ohne das Gewebe zu schädigen und die Zellen durch Anregung mit Laserleistung zu aktivieren. Die Multiphotonenmikroskopie ist die Bildgebungsmethode der Wahl für die Visualisierung fluoreszenzmarkierter Zellen und Strukturen in lebenden Tieren, da sie die Fluorophore mit minimaler Phototoxizität tiefer in das Gewebe/die Organe anregen kann8.
Die Verwendung von abgestimmten Infrarotlasern mit Pulsen, die in Femtosekundenintervallen abgegeben werden, regt das Fluorochrom nur in der Brennebene an, ohne Anregung oberhalb und unterhalb der Brennebene8. Somit ermöglicht die Multiphotonenmikroskopie eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, weniger Lichtschäden und eine erhöhte Gewebedurchdringungsbildgebung zur Untersuchung dynamischer biologischer Ereignisse in den Organen. Es ist ein ideales Mikroskopiewerkzeug für die Bildgebung lebender Tiere. Multiphotonen und jede andere Kunst der intravitalen Mikroskopie sind jedoch durch Gewebebewegungen aufgrund von Herzschlag, Atmung, peristaltischen Bewegungen, Muskeltonalität und anderen physiologischen Funktionen begrenzt, was die Bildaufnahme und -analyse stört. Da diese Bewegungen die zeitliche und räumliche Auflösung beeinträchtigen und manchmal sogar eine nachträgliche Analyse verhindern, müssen sie angemessen berücksichtigt werden, um eine genaue Datenanalyse und -interpretation zu ermöglichen. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Artefakte durch Gewebebewegungen zu verringern oder zu verhindern. Dieses Protokoll wendet eine In-situ-Driftkorrektursoftware namens VivoFollow9 an, um die Gewebedrift während der Bildaufnahme zu korrigieren. Dieser Ansatz bietet die erforderliche Bildstabilisierung und ermöglicht eine Langzeitbildgebung und Zellverfolgungsanalyse.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

Die Arteriogenese hängt stark von der Rekrutierung von Leukozyten und Thrombozyten in den perivaskulären Raum wachsender Kollateralgefäße ab. Der Standardansatz für die Analyse von Kollateralarterien und Leukozyten in der Arteriogenese ist die ex vivo (immun-)histologische Methodik. Diese Technik erlaubt jedoch nicht die Messung dynamischer Prozesse wie Blutfluss, Scherspannung, Zell-Zell-Wechselwirkungen und Partikelgeschwindigkeit. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Überwachung von In-vivo-Prozessen in wachsenden Kollateralarterien während der Arteriogenese unter Verwendung intravitaler Bildgebung vorgestellt. Die hier beschriebene Methode ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Dynamikmessung und bietet eine kontrastreiche Analyse mit minimaler Photozytotoxizität, die durch Multiphotonen-Anregungsmikroskopie ermöglicht wird. Vor der Analyse wachsender Kollateralarterien wurde die Arteriogenese im Adduktorenmuskel von Mäusen durch einseitige Ligatur der Oberschenkelarterie induziert.
Nach der Ligatur begannen die bereits vorhandenen Kollateralarterien aufgrund der erhöhten Scherspannung zu wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation wurden die Haut und das Unterhautfett über den Seitenarterien entfernt, wodurch eine Tasche für weitere Analysen entstand. Um den Blutfluss und die Immunzellen während der In-vivo-Bildgebung sichtbar zu machen, wurden CD41-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (Thrombozyten) und CD45-Phycoerythrin (PE) (Leukozyten) Antikörper intravenös (i.v.) über einen Katheter injiziert, der in die Schwanzvene einer Maus gelegt wird. In diesem Artikel wird die intravitale Multiphotonenbildgebung als Alternative oder in vivo Ergänzung zu den häufig verwendeten statischen ex vivo (immun-) histologischen Analysen zur Untersuchung von Prozessen vorgestellt, die für die Arteriogenese relevant sind. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neuartige und dynamische in vivo Methode zur Untersuchung des Immunzelltransports, des Blutflusses und der Scherbelastung in einem Hintergliedmaßenmodell der Arteriogenese, was die Evaluierungsmöglichkeiten erheblich verbessert.

Die Multiphotonenmikroskopie bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung für das Leukozyten-Tracking, wobei Zellmigrationsschritte und -geschwindigkeiten verfolgt und überwacht werden können (Abbildung 4A,B). Die physiologische Bewegung der Probe stellt jedoch eine Herausforderung dar, insbesondere für Langzeitaufnahmen in der Intravitalmikroskopie. Daher sind eine gute Gewebepräparation und Halterungen zur Fixierung des Gewebes sowie Werkzeuge, wie z. B. die E...

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Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den Prozess der Arteriogenese in vivo zu analysieren, indem sie die Adhärenz und Extravasation von Immunzellen in wachsenden Kollateralarterien in Echtzeit verfolgen. Die Multiphotonenmikroskopie-Technik ermöglicht die Visualisierung der Zelldynamik im tiefen Gewebe lebender Mausmodelle mit geringer Phototoxizität und hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Das mikroskopische Verfahren wird von Dominic van den Heuvel, einem technischen Assistenten der Multiphotonen-Bildgebungsplattform aus dem Labor von Dr. Helen Ishikawa-Ankerhold, demonstriert.Ich werde den chirurgischen Eingriff demonstrieren. Legen Sie die betäubte Maus zunächst in Rückenlage. Legen Sie dann zwei Stücke geformten Ton unter die obere Hintergliedmaße der Maus, um eine ebene Position des Adduktorenmuskels zu gewährleisten.Legen Sie die Maus unter das Stereomikroskop. Nachdem Sie die Haare von beiden Beinen entfernt haben, desinfizieren und schneiden Sie die Haut kreisförmig um die Narbe der früheren Oberschenkelarterie der rechten Hintergliedmaße. Entfernen Sie die Haut- und Fettschicht von der Oberseite des Beins und ziehen Sie die restliche Haut mit Nähten beiseite, um eine Tasche um den Adduktorenmuskel mit den Seitengefäßen zu schaffen.Als nächstes entfernen Sie das Unterhautfett, um eine klare Sicht auf den Adduktorenmuskel, die Arteria profunda und die Vene profunda sowie die Seitengefäße zu erhalten. Entfernen Sie die oberflächliche Muskelschicht auf den Seitengefäßen mit einer feinen Pinzette. Füllen Sie die vorbereitete Tasche mit Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, und fahren Sie mit dem gleichen Verfahren für die scheinoperierte linke Hintergliedmaße fort.Geben Sie vor der Bildgebung Ultraschallgel in beide Taschen, das ein Austrocknen verhindert und als Immersionsmedium für die optische Kopplung mit dem Objektiv dient. Schalten Sie den Schlüssel der Titan-Saphir-Laserbox, der Box für elektronische Schnittstellen, der Heizeinheit der Inkubatorkammer, der Leuchtstofflampe und des Computers ein. Starten Sie die Erfassungssoftware.Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 Nanometer ein und öffnen Sie den Verschluss des Mikroskops. Wählen Sie im Dialog des Messassistenten den Gerätemodus als Einzelstrahl und den Messmodus als 3D-Scan-Zeitraffer aus. Anschließend wird die anästhesierte Maus in die vorgewärmte Inkubationskammer des Mikroskops überführt und der Bereich mit dem Ultraschallgel direkt in Kontakt mit der Objektivfrontlinse positioniert.Öffnen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops. Wählen Sie dann einen geeigneten Filter oder eine dichroitische Einstellung für die FTSE-Visualisierung. Definieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie den Blutfluss unter Epifluoreszenzbeleuchtung verfolgen.Nachdem Sie den interessierenden Bereich in das mittlere Sichtfeld gebracht haben, schließen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops. Stellen Sie im Dialogfeld XY-Scanner die erforderlichen Parameter für Bildgröße, Pixel, Frequenz und Liniendurchschnitt ein. Passen Sie die Laserleistung an und stellen Sie die Verstärkung des Fotomultiplikators für die Kanäle Grün, Rot und Blau ein.Wählen Sie ein geeignetes Objektiv für die intravitale Bildgebung und die Einstellungen für die Driftkorrektur. Definieren Sie den Bildstapelbereich, indem Sie den Vorschauaufnahmemodus starten, indem Sie die rote Taste im Dialogfenster des Messassistenten drücken. Um gute Bilder zu erhalten, definieren Sie den Bereich und die Struktur des Interesses durch Fokussieren.Ändern Sie während der Beobachtung des Bildschirms den Fokus, indem Sie das Objektiv bewegen, bis das Bild verschwindet, und stellen Sie es auf Null ein. Stellen Sie die Objektivposition als letzte Position in axialer Richtung ein. Ändern Sie dann den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie das Objektiv nach unten bewegen, bis das Bild wieder vom Bildschirm verschwindet.Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp in der oberen linken Ecke des Dialogfelds des Messassistenten und stellen Sie die Schrittweite auf zwei Mikrometer ein. Wählen Sie die Python-Achse als erstes Achsgerät im Dialogfeld des Messassistenten aus und wählen Sie den Auto-Save-Modus nicht aktivieren. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen zum automatischen Speichern nur auf der Zeitachse.Klicken Sie anschließend auf das Python-Symbol im Fenster "Verfügbare Geräte", um das Python-Dialogfenster zu öffnen. Geben Sie in den Achseneinstellungen des Python-Dialogfelds die Abschnitte "von" und "bis" ein und geben Sie dann die Anzahl der Schritte ein. Rufen Sie das Dialogfenster XYZ-Stufe Z auf und vergrößern Sie den Scanbereich an beiden Enden um 200 Mikrometer.Geben Sie dazu 200 Mikrometer in start und minus 240 Mikrometer in end ein und der Bereich wird automatisch auf minus 440 Mikrometer eingestellt. Öffnen Sie den VivoFollow-Frontend-Dialog. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die grüne Pfeilspitze in der oberen linken Ecke des Dialogfelds des Messassistenten drücken.Wenn die Live-Driftkorrektur verwendet wird, suchen Sie nach einem Dialogfeld, in dem die Konfiguration der Driftkorrektur angezeigt wird. Legen Sie dann den Erfassungskanal fest, der wie in einer mobilen Landmarkenreferenz verwendet wird. Geben Sie den maximalen Korrekturversatz in Mikrometern ein, der zur ersten und letzten Z-Position addiert wird, und klicken Sie auf OK. Überwachen Sie den aktuellen Drift-Offset in X, Y und Z in Echtzeit während der Bildaufnahme im vivo flow-Frontend-Dialogfenster und stoppen Sie die Bildaufnahme nach 35 Minuten, wenn ein weiterer Zyklus der Anästhesie-Reinjektion erforderlich ist.Injizieren Sie eine halbe Dosis der MMF-Mischung und starten Sie die Bildaufnahme neu, bis das Experiment abgeschlossen ist. Dieses Tool ermöglicht eine langfristige Bildaufnahme, ermöglicht eine qualitativ hochwertige Datenerfassung und eignet sich zum Tracking der Zellen für Geschwindigkeitsmessungen. Wie ohne Driftkorrektur gezeigt, driftet der interessierende Bereich zunehmend von der Aufzeichnungsansicht weg, was sich auf die Fähigkeit auswirkt, Zellen für die Geschwindigkeitsanalyse zu verfolgen.Mit der Driftkorrektur-Software können jedoch stabile Filme aufgezeichnet und mehr Zellen über einen langen Zeitraum verfolgt werden. Die Driftkorrektursoftware kann auch eine Visualisierung der X-, Y- und Z-Offsets im Laufe der Zeit bereitstellen, die vom System korrigiert wurden. Die Multiphotonenmikroskopie bietet eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung für die Leukozytenverfolgung, wobei Zellmigrationsschritte und -geschwindigkeiten verfolgt und überwacht werden können.Durch die Vorbereitung der Kollateralgefäße für die Multiphotonen-Bildgebung ist es wichtig, eine Schädigung der Kollateralarterien zu vermeiden. Vor der Bildgebung ist es wichtig, die richtige Kollateralarterie sicher zu identifizieren. Mit diesem neuen Verfahren der intravitalen Multiphotonen-Bildgebung der Kollateralarterien ist es möglich, die Adhärenz und Extravasation aller Blutzellen in vivo durch Änderung der Antikörpermarkierung zu analysieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...