Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

המחקר מומן על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, פרויקט Z01). אנו מודים לד"ר סוזן שטוט על קריאת כתב היד.

מחקר זה אושר על ידי הוועדה הבווארית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אושר על ידי הקוד האתי: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); ניסויים אלה בוצעו בהתאמה קפדנית להנחיות החקיקה הגרמנית בנושא בעלי חיים.
1. בעלי חיים וקשירת עורק הירך (FAL)
הערה: כדי לגרום לדלקת סטרילית ולדלקת עורקים, נעשה שימו...

<ol>
	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

השיטה המתוארת של ניתוח multiphoton in vivo של גיוס לויקוציטים מייצגת תוספת לכלים נפוצים למחקרי גיוס לויקוציטים כגון ניתוחים היסטולוגיים (חיסוניים) או FACS. בשיטת הדמיה זו, ניתן לדמיין בפירוט רב יותר את התהליכים הדינמיים בהידבקות לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך ארטריוגנזה10. למרות ה?...

למרות העניין המחקרי האינטנסיבי בשנים האחרונות, מחלות לב וכלי דם, כגון מחלות לב איסכמיות ושבץ, הן עדיין סיבת המוות העולמית המובילה1. הטיפולים הנוכחיים למחלות אלה הם טיפולים פולשניים ביותר כגון אנגיופלסטיקה טרנסלומינלית מלעורית, אנגיופלסטיקה כלילית טרנסלומינלית מלעורית, או ניתוח מעקפים2. לכן, יש צורך דחוף בפיתוח אפשרויות טיפוליות אלטרנטיביות, לא פולשניות. הגוף יכול ליצור מעקפים טבעיים סביב כלי דם היצרות או חסום כדי להפנות את זרימת הדם המופרעת לחלק הדיסטלי של ההיצרות. תהליך זה נקרא arteriogenesis2. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה הראו כי גזירה מוגברת של נוזלים משפיעה על גיוס לויקוציטים, אשר ממלא תפקיד חשוב במהלך arteriogenesis3. האפשרויות הנוכחיות העיקריות לנתח את גיוס לויקוציטים במהלך arteriogenesis הן ex vivo (immuno-) ניתוחים היסטולוגיים או מתודולוגיית מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות (FACS)4. כדי לאפשר הערכה של דינמיקה לויקוציטים במהלך ארטריוגנזה, מאמר זה מציג פרוטוקול הדמיה תוך חיוני עם מיקרוסקופ מולטיפוטון.
לויקוציטים הם תאי הדם העיקריים שגויסו בתהליך של arteriogenesis3. פרוטוקול זה משתמש בהדמיית מולטיפוטונים כדי להראות את הזחילה של לויקוציטים דבקים המסומנים בנוגדנים מוזרקים נגד CD45-PE בעורקים בטחוניים, 24 שעות לאחר השראת העורקים על ידי קשירת עורק הירך (FAL) תוך שימוש באיסכמיה של גפיים אחוריות מוריןמודל 5,6. לחלופין, ניתן לתייג תאי חיסון ex vivo ולהזריק בזהירות לעכברים, כפי שהוכח במחקרים על אנגיוגנזה באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני7. זרימת הדם בתוך כלי דם ועורקים יכולה להיות דמיונית על ידי CD41-FITC (כדי לסמן טסיות), dextran-FITC (פלזמה), או על ידי הדור ההרמוני השני (SHG), אשר מדמה קולגן סוג 1 נוכח בקרום המרתף של חלק כלשהו של עץ כלי הדם. SHG הוא אפקט תיוג חופשי ייחודי של עירור מולטיפוטונים. דימות מולטיפוטונים מאפשר מעקב תאים ארוך טווח מבלי לפגוע ברקמה ולהפעיל את התאים על ידי עירור כוח לייזר. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא שיטת ההדמיה המועדפת להדמיית תאים ומבנים המסומנים באופן פלואורסצנטי בבעלי חיים בשל יכולתה לעורר את הפלואורופורים עמוק יותר לתוך הרקמה/איברים עם רעילות אור מינימלית8.
השימוש בלייזרים אינפרא אדום מכווננים עם פולסים המועברים במרווחי פמטו-שניות מעורר את הפלואורוכרום רק במישור המוקד, ללא עירור מעל ומתחת למישור המוקד8. לפיכך, מיקרוסקופ מולטיפוטונים מאפשר רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, פחות נזקי אור והדמיית חדירה מוגברת של רקמות לחקר אירועים ביולוגיים דינמיים בתוך האיברים. זהו כלי מיקרוסקופיה אידיאלי להדמיית בעלי חיים חיים. עם זאת, מולטיפוטון וכל אמנות אחרת של מיקרוסקופיה תוך חיונית מוגבלת על ידי תנועת רקמות עקב פעימות לב, נשימה, תנועות פריסטלטיות, טונאליות שרירים ותפקודים פיזיולוגיים אחרים, מה שמפריע לרכישת הדימות ולניתוחו. מכיוון שתנועות אלה פוגעות ברזולוציה הזמנית והמרחבית ולעיתים אף אוסרות על ניתוח עוקב, יש להתייחס אליהן כראוי כדי לאפשר ניתוח ופרשנות מדויקים של נתונים. מספר אסטרטגיות פותחו כדי להוריד או למנוע ממצאים מתנועת רקמות. פרוטוקול זה מיישם תוכנה לתיקון סחף באתרו בשם VivoFollow9 כדי לתקן סחף רקמות במהלך רכישת תמונה. גישה זו מספקת את ייצוב התמונה הנדרש, ומאפשרת הדמיה ארוכת טווח וניתוח מעקב אחר תאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

Arteriogenesis תלוי מאוד לויקוציטים וגיוס טסיות לחלל perivascular של כלי בטחונות גדלים. הגישה הסטנדרטית לניתוח עורקים בטחוניים ולויקוציטים בארטריוגנזה היא מתודולוגיה היסטולוגית ex vivo (immuno-). עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת מדידה של תהליכים דינמיים כגון זרימת דם, מתח גזירה, אינטראקציות בין תאים ומהירות חלקיקים. מאמר זה מציג פרוטוקול לניטור תהליכי in vivo בצמיחת עורקים בטחוניים במהלך ארטריוגנזה באמצעות הדמיה תוך חיונית. השיטה המתוארת כאן היא כלי אמין למדידת דינמיקה ומציעה ניתוח ניגודיות גבוהה עם ציטוטוקסיות פוטו מינימלית, המסופקת על ידי מיקרוסקופ עירור מולטיפוטונים. לפני ניתוח העורקים הבטחוניים הגדלים, הושרה ארטריוגנזה בשריר האדוקטור של עכברים על ידי קשירה חד צדדית של עורק הירך.
לאחר הקשירה, העורקים הקולטרליים הקיימים החלו לגדול עקב לחץ גזירה מוגבר. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח הוסרו העור והשומן התת עורי שמעל עורקי הצידית, ונוצר כיס לניתוחים נוספים. כדי להמחיש את זרימת הדם ואת תאי החיסון במהלך הדמיית in vivo , CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (טסיות) ונוגדנים CD45-phycoerythrin (PE) (לויקוציטים) הוזרקו תוך ורידי (i.v.) באמצעות קטטר שהונח בווריד הזנב של עכבר. מאמר זה מציג דימות מולטיפוטון תוך-חיוני כחלופה או כהשלמה in vivo לניתוחים ההיסטולוגיים הסטטיים הנפוצים ex vivo (immuno-) כדי לחקור תהליכים רלוונטיים לעורקים. לסיכום, מאמר זה מתאר שיטה חדשנית ודינמית in vivo לחקר סחר בתאי מערכת החיסון, זרימת הדם ולחץ גזירה במודל גפיים אחוריות של ארטריוגנזה, אשר משפר את אפשרויות ההערכה באופן משמעותי.

מיקרוסקופ מולטיפוטונים מציע רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה למעקב אחר לויקוציטים, שבו ניתן לעקוב אחר שלבי נדידת תאים ומהירותם ולנטר אותם (איור 4A,B). עם זאת, התנועה הפיזיולוגית של הדגימה מהווה אתגר, במיוחד עבור רכישות ארוכות טווח של תמונות מיקרוסקופיה תוך חיונית. לכ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לנתח את תהליך ה-arteriogenesis in vivo על ידי מעקב אחר היצמדות תאי מערכת החיסון ואקסטרווסציה בגידול עורקים בטחונים בזמן אמת. טכניקת המיקרוסקופ הרב-פוטוני מאפשרת הדמיה של דינמיקה תאית ברקמה העמוקה של מודלים של עכברים חיים עם פוטוטוקסיות נמוכה ועם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. הליך המיקרוסקופ יודגם על ידי דומיניק ואן דן היובל, עוזר טכני מפלטפורמת הדמיה מולטיפוטון מהמעבדה של ד"ר הלן אישיקאווה-אנקרהולד.אני אדגים את ההליך הכירורגי. כדי להתחיל, מקם את העכבר המרדים במצב שכיבה. לאחר מכן הניחו שתי חתיכות של חימר יצוק מתחת לגפה האחורית העליונה של העכבר כדי להבטיח מיקום מישורי של שריר האדוקטור.מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. לאחר הסרת השיער משתי הרגליים, יש לחטא ולחתוך את העור במעגל סביב הצלקת של קשירת עורק הירך הקודמת של הגפה האחורית הימנית. הסר את העור ואת שכבת השומן מהחלק העליון של הרגל ומשוך הצידה את העור שנותר באמצעות תפרים כדי ליצור כיס סביב שריר האדוקטור עם כלי הדם הקולטרליים.לאחר מכן, להסיר את השומן תת עורי כדי לקבל חזון ברור של שריר adductor, עורק profunda ווריד, כמו גם את כלי הדם. הסר את שכבת השריר השטחית על גבי כלי הדם הבטחוניים באמצעות מלקחיים עדינים. מלאו את הכיס המוכן במי מלח כדי למנוע מהרקמה להתייבש והמשיכו באותו הליך עבור הגפה האחורית השמאלית המופעלת על ידי דמה.לפני ההדמיה מוסיפים ג'ל אולטראסוני לשני הכיסים המונע ייבוש ומשמש כמדיום טבילה לצימוד אופטי עם המטרה. הפעל את המפתח של תיבת הלייזר ספיר טיטניום, תיבת הממשקים האלקטרוניים, יחידת החימום של תא האינקובטור, מנורת הפלואורסצנט והמחשב. הפעל את תוכנת הרכישה.כוונו את אורך הגל ל-800 ננומטר ופתחו את תריס המיקרוסקופ. בתיבת הדו-שיח של אשף המדידה, בחרו במצב המכשיר כאלומה יחידה ובמצב מדידה כקיטוע זמן של סריקה תלת-ממדית. לאחר מכן להעביר את העכבר המרדים לתוך תא הדגירה שחומם מראש של המיקרוסקופ ולמקם את האזור עם ג'ל קולי ישירות במגע עם העדשה הקדמית האובייקטיבית.פתח את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי. לאחר מכן בחרו מסנן מתאים או הגדרה דיכרואית לתצוגה חזותית של FTSE. הגדר את תחום העניין על ידי מעקב אחר זרימת הדם תחת תאורה אפיפלואורסצנטית.לאחר הכנסת אזור העניין לשדה הראייה המרכזי, סגרו את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי. בתיבת הדו-שיח סורק XY, הגדר את הפרמטרים הדרושים עבור גודל תמונה, פיקסל, תדירות, ממוצע קו. התאם את עוצמת הלייזר והגדר את רווח מכפיל התמונה עבור הערוצים בירוק, אדום וכחול.בחר מטרה מתאימה להגדרות הדמיה תוך-חיונית ותיקון סחף. הגדירו את טווח אוסף התמונות באמצעות הפעלת מצב רכישת התצוגה המקדימה בלחיצה על הלחצן האדום בחלון הדו-שיח של אשף המדידות. כדי לקבל תמונות טובות, הגדר את האזור והמבנה של העניין על ידי התמקדות.בעת התבוננות במסך, שנה את המיקוד על ידי הזזת המטרה עד להיעלמות התמונה והגדר אותה כאפס. הגדר את המיקום האובייקטיבי כמיקום האחרון בכיוון הצירי. לאחר מכן שנו את המיקוד בכיוון ההפוך על ידי הזזת המטרה כלפי מטה עד שהתמונה תיעלם שוב מהמסך.לחצו על לחצן העצירה בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח של אשף המדידה והגדירו את גודל המדרגה לשני מיקרומטרים. בחרו בציר פיתון כהתקן הציר הראשון בתיבת הדו-שיח של אשף המדידה ובחרו 'אל תפעילו את מצב השמירה האוטומטית'. לאחר מכן סמן את תיבת השמירה האוטומטית רק בציר הזמן.לאחר מכן, לחץ על סמל Python בחלון המכשירים הזמינים כדי לפתוח את חלון הדו-שיח Python. בהגדרות ציר הדו-שיח Python, הזן מקטעים מאת ואל ולאחר מכן הזן את מספר השלבים. עבור אל חלון הדו-שיח XYZ שלב Z והגדל את טווח הסריקה ב -200 מיקרומטר בשני הקצוות.לשם כך, הזן 200 מיקרומטר בהתחלה והזן מינוס 240 מיקרומטר בסוף והטווח יוגדר אוטומטית כמינוס 440 מיקרומטר. פתח את תיבת הדו-שיח החזיתית של VivoFollow. התחל רכישת תמונה על-ידי לחיצה על ראש החץ הירוק בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח של אשף המדידה.אם נעשה שימוש בתיקון סחף חי, חפש תיבת דו-שיח להופעת תצורת תיקון הסחף. לאחר מכן הגדר את ערוץ הרכישה המשמש כמו בהפניה לציון דרך נייד. הזינו את הסטת התיקון המרבית במיקרומטרים שנוספו למיקום Z הראשון והאחרון, ולחצו על הלחצן 'אשר'. נטר את הסטת הסחף הנוכחית ב- X, Y ו- Z בזמן אמת במהלך רכישת התמונה בחלון הדו-שיח החזיתי vivo flow והפסק את רכישת ההדמיה לאחר 35 דקות כאשר נדרש מחזור נוסף של הזרקה חוזרת של הרדמה.הזריקו חצי מנה של תערובת MMF והפעילו מחדש את רכישת ההדמיה עד לסיום הניסוי. כלי זה מאפשר רכישת תמונה לטווח ארוך, מאפשר איסוף נתונים באיכות גבוהה ומתאים למעקב אחר התאים למדידות מהירות. כפי שמוצג ללא תיקון סחף, האזור המעניין מתרחק בהדרגה מתצוגת ההקלטה, מה שמשפיע על היכולת לעקוב אחר תאים לצורך ניתוח מהירות.עם זאת, ניתן להקליט סרטים יציבים באמצעות תוכנת תיקון הסחף וניתן לעקוב אחר תאים נוספים לאורך תקופה ארוכה. התוכנה לתיקון סחף יכולה גם לספק תצוגה חזותית של היסט X, Y ו- Z לאורך זמן שתוקן על-ידי המערכת. מיקרוסקופ מולטיפוטון מציע רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה למעקב לויקוציטים שבו ניתן לעקוב אחר שלבי נדידת התאים ומהירותם ולנטר אותם.על ידי הכנת כלי הדם הבטחונים להדמיית מולטיפוטונים, חיוני למנוע נזק לעורקי הבטחונות. לפני ההדמיה, חשוב לזהות בבטחה את העורק הבטחוני הנכון. עם הליך חדש זה של הדמיה multiphoton intravital של העורקים בטחונות, ניתן לנתח דבקות ו extravasation של כל תאי הדם in vivo על ידי שינוי תווית נוגדנים.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

שיטות חריפה subacute Murine Hindlimb איסכמיה

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

משולב מיקרוסקופ Intravital משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד של Hindlimb העכבר ללמוד Vasodilation הנוצרות על-ידי אינסולין זלוף שריר

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...