Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

अध्ययन को डॉयचे फोर्सचुंगस्जेमिनशाफ्ट एसएफबी 914 (एचआई-ए / एसएम, प्रोजेक्ट जेड 01) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ सुज़ैन स्टट को धन्यवाद देते हैं।

इस अध्ययन को बवेरियन पशु देखभाल और उपयोग समिति (नैतिक कोड द्वारा अनुमोदित: आरओबी-55.2वेट-2532.Vet_02-17-99) द्वारा अनुमोदित किया गया था; ये प्रयोग जर्मन पशु कानून दिशानिर्देशों के अनुसार सख्ती से किए गए थे।
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

ल्यूकोसाइट भर्ती के विवो विश्लेषण में मल्टीफोटॉन की वर्णित विधि ल्यूकोसाइट भर्ती अध्ययन जैसे (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल या एफएसीएस विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के अतिरिक्त क?...

हाल के वर्षों के दौरान गहन शोध रुचि के बावजूद, कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां, जैसे, इस्केमिक हृदय रोग और स्ट्रोक, अभीभी मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण हैं। इन बीमारियों के लिए वर्तमान उपचार अत्यधिक आक्रामक उपचार हैं जैसे कि पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल एंजियोप्लास्टी, पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल कोरोनरी एंजियोप्लास्टी, या बाईपास सर्जरी2। इसलिए, वैकल्पिक, गैर-इनवेसिव चिकित्सीय विकल्पों के विकास की तत्काल आवश्यकता है। शरीर स्टेनोसिस के बाहर के हिस्से में बाधित रक्त प्रवाह को पुनर्निर्देशित करने के लिए एक स्टेनोसेड या अवरुद्ध वाहिका के चारों ओर प्राकृतिक बाईपास बना सकता है। इस प्रक्रिया को धमनीजनन2 कहा जाता है। कई हालिया अध्ययनों से पता चला है कि द्रव कतरनी में वृद्धि ल्यूकोसाइट भर्ती को प्रभावित करती है, जो धमनीजनन3 के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट्स की भर्ती का विश्लेषण करने के लिए मुख्य वर्तमान विकल्प एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) पद्धति4 हैं। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट गतिशीलता के मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, यह पेपर मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एक इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
ल्यूकोसाइट्स धमनीजनन की प्रक्रिया के दौरान भर्तीकी जाने वाली प्रमुख रक्त कोशिकाएं हैं। यह प्रोटोकॉल मल्टीफोटॉन इमेजिंग का उपयोग करता है ताकि संपार्श्विक धमनियों में इंजेक्टेड एंटी-सीडी 45-पीई एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए अनुयायी ल्यूकोसाइट्स के रेंगने को दिखाया जा सके, फेमोरल धमनी बंधाव (एफएएल) द्वारा धमनीजनन के प्रेरण के 24 घंटे बाद, एक मुराइन हिंदलिम्ब इस्किमिया मॉडल 5,6 का उपयोग करके। वैकल्पिक रूप से, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक्स विवो लेबल किया जा सकता है और चूहों में सावधानीपूर्वक इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसा कि इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी7 का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस पर अध्ययन में दिखाया गया है। वाहिकाओं और धमनियों के अंदर रक्त प्रवाह को सीडी 41-एफआईटीसी (प्लेटलेट्स लेबल करने के लिए), डेक्सट्रान-एफआईटीसी (प्लाज्मा), या दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) द्वारा देखा जा सकता है, जो संवहनी पेड़ के कुछ हिस्से के तहखाने झिल्ली में मौजूद कोलेजन टाइप 1 की कल्पना करता है। एसएचजी मल्टीफोटॉन उत्तेजना का एक अनूठा मुक्त लेबलिंग प्रभाव है। मल्टीफोटॉन इमेजिंग ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना और लेजर पावर उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं को सक्रिय किए बिना दीर्घकालिक सेल ट्रैकिंग की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं और संरचनाओं को देखने के लिए पसंद की इमेजिंग विधि है क्योंकि यह फ्लोरोफोर को ऊतक / अंगों में गहराई से उत्तेजित करने की क्षमता के कारणहै।
फेम्टोसेकंड अंतराल के भीतर वितरित दालों के साथ ट्यून किए गए इन्फ्रारेड लेजर का उपयोग केवल फोकल प्लेन पर फ्लोरोक्रोम को उत्तेजित करता है, जिसमें फोकल प्लेन8 के ऊपर और नीचे कोई उत्तेजना नहीं होती है। इस प्रकार, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी अंगों के अंदर गतिशील जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन, कम फोटो-क्षति और ऊतक प्रवेश इमेजिंग में वृद्धि की अनुमति देता है। यह लाइव-पशु इमेजिंग के लिए एक आदर्श माइक्रोस्कोपी उपकरण है। हालांकि, मल्टीफोटॉन और इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की कोई अन्य कला दिल की धड़कन, श्वसन, पेरिस्टाल्टिक आंदोलनों, मांसपेशियों की टोनैलिटी और अन्य शारीरिक कार्यों के कारण ऊतक गति से सीमित है, जो इमेजिंग अधिग्रहण और विश्लेषण को परेशान करती है। चूंकि ये आंदोलन अस्थायी और स्थानिक संकल्प को खराब करते हैं और कभी-कभी बाद के विश्लेषण को भी प्रतिबंधित करते हैं, इसलिए उन्हें सटीक डेटा विश्लेषण और व्याख्या को सक्षम करने के लिए उचित रूप से संबोधित किया जाना चाहिए। ऊतक गति से कलाकृतियों को कम करने या रोकने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है। यह प्रोटोकॉल छवि अधिग्रहण के दौरान ऊतक बहाव को सही करने के लिए VivoFollow9 नामक एक सीटू बहाव सुधार सॉफ्टवेयर लागू करता है। यह दृष्टिकोण आवश्यक छवि स्थिरीकरण प्रदान करता है, जो दीर्घकालिक इमेजिंग और सेल-ट्रैकिंग विश्लेषण को सक्षम करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

धमनीजनन दृढ़ता से बढ़ते संपार्श्विक वाहिकाओं के पेरिवास्कुलर स्थान पर ल्यूकोसाइट और प्लेटलेट भर्ती पर निर्भर करता है। धमनीजनन में संपार्श्विक धमनियों और ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए मानक दृष्टिकोण एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल पद्धति है। हालांकि, यह तकनीक रक्त प्रवाह, कतरनी तनाव, सेल-सेल इंटरैक्शन और कण वेग जैसी गतिशील प्रक्रियाओं के माप की अनुमति नहीं देती है। यह पेपर इंट्रावाइटल इमेजिंग का उपयोग करके धमनीजनन के दौरान बढ़ती संपार्श्विक धमनियों में विवो प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यहां वर्णित विधि गतिशीलता माप के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है और मल्टीफोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई न्यूनतम फोटो-साइटोटॉक्सिसिटी के साथ एक उच्च-कंट्रास्ट विश्लेषण प्रदान करती है। बढ़ती संपार्श्विक धमनियों का विश्लेषण करने से पहले, ऊरु धमनी के एकतरफा बंधाव द्वारा चूहों की जोड़ की मांसपेशियों में धमनीजनन को प्रेरित किया गया था।
बंधाव के बाद, कतरनी तनाव में वृद्धि के कारण पहले से मौजूद संपार्श्विक धमनियां बढ़ने लगीं। सर्जरी के चौबीस घंटे बाद, संपार्श्विक धमनियों के ऊपर की त्वचा और चमड़े के नीचे की वसा को हटा दिया गया, जिससे आगे के विश्लेषण के लिए एक जेब का निर्माण हुआ। विवो इमेजिंग के दौरान रक्त प्रवाह और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, सीडी 41-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (प्लेटलेट्स) और सीडी 45-फाइकोएरिथ्रिन (पीई) (ल्यूकोसाइट्स) एंटीबॉडी को एक माउस की पूंछ की नस में रखे कैथेटर के माध्यम से अंतःशिरा (यानी) इंजेक्ट किया गया था। यह लेख इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन इमेजिंग को एक विकल्प के रूप में या आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले स्थैतिक एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए विवो पूरक के रूप में पेश करता है ताकि धमनीजनन के लिए प्रासंगिक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके। सारांश में, यह पेपर धमनीजनन के हिंदलिम्ब मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी, रक्त प्रवाह और कतरनी तनाव की जांच करने के लिए विवो विधि में एक उपन्यास और गतिशील का वर्णन करता है, जो मूल्यांकन संभावनाओं को विशेष रूप से बढ़ाता है।

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी ल्यूकोसाइट ट्रैकिंग के लिए एक उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, जिसमें सेल माइग्रेशन चरणों और गति को ट्रैक और मॉनिटर किया जा सकता है (चित्रा 4 ए, ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की भर्ती धमनीजनन के दौरान संपार्श्विक धमनियों के प्रभावी विकास के लिए आवश्यक एक आवश्यक घटक का गठन करती है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी विवो में उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एक कुशल उपकरण है और धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट भर्ती और एक्स्ट्रावेसन का अध्ययन करने के लिए कम फोटो-टॉक्सिसिटी है।

म्यूरिन हिंदलिम्ब मॉडल में धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट भर्ती की निगरानी के लिए मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

हमारा प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में बढ़ती संपार्श्विक धमनियों में प्रतिरक्षा कोशिका पालन और अतिरिक्तता को ट्रैक करके विवो में धमनीजनन की प्रक्रिया का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक कम फोटोटॉक्सिसिटी के साथ और उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ जीवित माउस मॉडल के गहरे ऊतक में सेल गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। माइक्रोस्कोप प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ. हेलेन इशिकावा-एंकरहोल्ड की प्रयोगशाला से मल्टीफोटॉन इमेजिंग प्लेटफॉर्म के एक तकनीकी सहायक डोमिनिक वैन डेन ह्यूवेल द्वारा किया जाएगा।मैं शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का प्रदर्शन करूंगा। शुरू करने के लिए, एनेस्थेटाइज्ड माउस को लापरवाह स्थिति में रखें। फिर जोड़ की मांसपेशियों की एक विमान स्थिति सुनिश्चित करने के लिए माउस के ऊपरी हिंदलिम्ब के नीचे ढाली हुई मिट्टी के दो टुकड़े रखें।स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे माउस रखें। दोनों पैरों से बालों को हटाने के बाद, त्वचा को कीटाणुरहित करें और दाहिने हिंदलिम्ब के पहले फेमोरल धमनी बंधाव के निशान के चारों ओर एक सर्कल में काट दें। पैर के शीर्ष से त्वचा और वसा की परत को हटा दें और संपार्श्विक वाहिकाओं के साथ जोड़ की मांसपेशियों के चारों ओर एक जेब बनाने के लिए सीवन का उपयोग करके शेष त्वचा को एक तरफ खींचें।इसके बाद, जोड़ की मांसपेशियों, प्रोफंडा धमनी और नस, साथ ही संपार्श्विक वाहिकाओं की स्पष्ट दृष्टि प्राप्त करने के लिए चमड़े के नीचे की वसा को हटा दें। ठीक बल का उपयोग करके संपार्श्विक वाहिकाओं के शीर्ष पर सतही मांसपेशी परत को हटा दें। ऊतक को सूखने से रोकने के लिए तैयार जेब को खारा से भरें और शाम संचालित बाएं हिंदलिम्ब के लिए एक ही प्रक्रिया जारी रखें।इमेजिंग से पहले, दोनों जेब में अल्ट्रासोनिक जेल जोड़ें जो सूखने से बचाता है और उद्देश्य के साथ ऑप्टिकल युग्मन के लिए विसर्जन माध्यम के रूप में कार्य करता है। टाइटेनियम नीलम लेजर बॉक्स, इलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस बॉक्स, इनक्यूबेटर कक्ष की हीटिंग इकाई, फ्लोरोसेंट लैंप और कंप्यूटर की कुंजी चालू करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।तरंग दैर्ध्य को 800 नैनोमीटर पर सेट करें और माइक्रोस्कोप शटर खोलें। मापन विज़ार्ड संवाद में, उपकरण मोड को एकल बीम के रूप में और माप मोड को 3D स्कैन टाइमलैप्स के रूप में चुनें. फिर एनेस्थेटाइज्ड माउस को माइक्रोस्कोप के पूर्व-गर्म इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें और अल्ट्रासोनिक जेल के साथ क्षेत्र को सीधे उद्देश्य फ्रंट लेंस के संपर्क में रखें।एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शटर खोलें। फिर एफटीएसई विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पर्याप्त फ़िल्टर या डाइक्रोइक सेटिंग चुनें। एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत रक्त प्रवाह का पालन करके रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें।रुचि के क्षेत्र को दृश्य के केंद्र क्षेत्र में लाने के बाद, एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप शटर को बंद करें। XY स्कैनर संवाद में, छवि आकार, पिक्सेल, आवृत्ति, लाइन औसत के लिए आवश्यक पैरामीटर सेट करें। लेजर शक्ति समायोजित करें और चैनलों हरे, लाल और नीले रंग के लिए फोटो गुणक लाभ सेट करें।इंट्रावाइटल इमेजिंग और बहाव सुधार सेटिंग्स के लिए पर्याप्त उद्देश्य का चयन करें। माप विज़ार्ड संवाद विंडो में लाल बटन दबाकर पूर्वावलोकन अधिग्रहण मोड प्रारंभ करके छवि स्टैक श्रेणी निर्धारित करें. अच्छी छवियां प्राप्त करने के लिए, ध्यान केंद्रित करके रुचि के क्षेत्र और संरचना को परिभाषित करें।स्क्रीन का अवलोकन करते समय, उद्देश्य को स्थानांतरित करके फ़ोकस बदलें जब तक कि छवि गायब न हो जाए और इसे शून्य के रूप में सेट करें। अक्षीय दिशा में अंतिम स्थान के रूप में उद्देश्य स्थिति निर्धारित करें। फिर उद्देश्य को नीचे ले जाकर विपरीत दिशा में फोकस बदलें जब तक कि छवि फिर से स्क्रीन से गायब न हो जाए।माप विज़ार्ड संवाद के ऊपरी बाएँ कोने पर स्टॉप बटन क्लिक करें और चरण आकार को दो माइक्रोमीटर पर सेट करें. माप विज़ार्ड संवाद में पहले अक्ष डिवाइस के रूप में पायथन अक्ष चुनें और ऑटो-सेव मोड को सक्रिय न करें का चयन करें। फिर ऑटो-सेव बॉक्स को केवल समय अक्ष पर चेक करें।इसके बाद, पायथन संवाद विंडो खोलने के लिए उपलब्ध डिवाइस विंडो में पायथन आइकन दबाएं। पायथन संवाद अक्ष सेटिंग्स में, अनुभागों से और उनके लिए दर्ज करें, फिर चरणों की संख्या दर्ज करें। XYZ चरण Z संवाद विंडो पर जाएं और स्कैन रेंज को दोनों सिरों पर 200 माइक्रोमीटर तक बढ़ाएं।ऐसा करने के लिए, शुरुआत में 200 माइक्रोमीटर दर्ज करें और अंत में माइनस 240 माइक्रोमीटर दर्ज करें और सीमा स्वचालित रूप से माइनस 440 माइक्रोमीटर के रूप में सेट हो जाएगी। VivoFollow फ़्रंट-एंड संवाद खोलें। माप विज़ार्ड संवाद के ऊपरी बाएँ कोने में हरे तीर का तीर दबाकर छवि अधिग्रहण प्रारंभ करें.यदि लाइव बहाव सुधार का उपयोग किया जाता है, तो बहाव सुधार कॉन्फ़िगरेशन प्रकट होने के लिए एक संवाद देखें. फिर मोबाइल लैंडमार्क संदर्भ के रूप में उपयोग किए जाने वाले अधिग्रहण चैनल को सेट करें। पहले और अंतिम Z पदों में जोड़े गए माइक्रोमीटर में अधिकतम सुधार ऑफसेट दर्ज करें, और ठीक पर क्लिक करें। विवो फ्लो फ्रंट-एंड डायलॉग विंडो में छवि अधिग्रहण के दौरान वास्तविक समय में एक्स, वाई और जेड में वर्तमान बहाव ऑफसेट की निगरानी करें और 35 मिनट के बाद इमेजिंग अधिग्रहण को रोक दें जब संज्ञाहरण पुन: इंजेक्शन के एक और चक्र की आवश्यकता हो।एमएमएफ मिश्रण की आधी खुराक इंजेक्ट करें और प्रयोग समाप्त होने तक इमेजिंग अधिग्रहण को फिर से शुरू करें। यह उपकरण दीर्घकालिक छवि अधिग्रहण की अनुमति देता है, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा संग्रह को सक्षम करता है, और गति माप के लिए कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए उपयुक्त है। जैसा कि बहाव सुधार के बिना दिखाया गया है, रुचि का क्षेत्र धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग दृश्य से दूर चला जाता है, जिससे गति विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता प्रभावित होती है।हालांकि, स्थिर फिल्मों को ड्रिफ्ट करेक्शन सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्ड किया जा सकता है और लंबी अवधि में अधिक कोशिकाओं को ट्रैक किया जा सकता है। बहाव सुधार सॉफ्टवेयर समय के साथ एक्स, वाई और जेड ऑफसेट का एक विज़ुअलाइज़ेशन भी प्रदान कर सकता है जिसे सिस्टम सही किया गया था। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी ल्यूकोसाइट ट्रैकिंग के लिए एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है जिसमें सेल माइग्रेशन चरणों और गति को ट्रैक और मॉनिटर किया जा सकता है।मल्टीफोटॉन इमेजिंग के लिए संपार्श्विक वाहिकाओं को तैयार करके, संपार्श्विक धमनियों को नुकसान से बचने के लिए आवश्यक है। इमेजिंग से पहले, सही संपार्श्विक धमनी को सुरक्षित रूप से पहचानना महत्वपूर्ण है। संपार्श्विक धमनियों के इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन इमेजिंग की इस नई प्रक्रिया के साथ, एंटीबॉडी लेबल को बदलकर विवो में सभी रक्त कोशिकाओं के पालन और बहिर्वाह का विश्लेषण करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Restenosis के अध्ययन के लिए कैरोटिड धमनी में स्टेंट आरोपण के एक murine मॉडल

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

एक orthotopic Glioblastoma माउस मॉडल मस्तिष्क parenchymal शारीरिक बाधाओं को बनाए रखने और intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

अनुक्रमिक<em&gt; में विवो</em&gt; अस्थिभंग मरम्मत के दौरान osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की इमेजिंग

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

एक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

तीव्र और subacute Murine hindlimb ischemia के लिए तरीके

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

संयुक्त Intravital माइक्रोस्कोपी और कंट्रास्ट-माउस Hindlimb की बढ़ी हुई स् ट्रा इंसुलिन प्रेरित Vasodilation और मांसपेशी छिड़काव का अध् ययन करने के लिए

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के intravital multiphoton इमेजिंग के लिए माउस कान त्वचा में उत्प्रेरण ischemia-reperfusion चोट

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा फुलमिंटेंट माईकार्डाइटिस के मरीन मॉडल में ल्यूकोसाइट फैलाने का मात्रात्मक विज़ुअलाइज़ेशन

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

परिधीय धमनी रोग के एक Murine मॉडल में Monocyte डाक और ट्यूमर से संबंधित Angiogenesis की Intravital माइक्रोस्कोपी

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

हिंडलिम्ब इस्किमिया के एक Murine मॉडल में चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस का आकलन

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...