Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Lo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, progetto Z01). Ringraziamo la dottoressa Susanne Stutte per aver letto il manoscritto.

Questo studio è stato approvato dal Comitato bavarese per la cura e l'uso degli animali (approvato dal codice etico: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); questi esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida tedesche sulla legislazione animale.
1. Animali e legatura dell'arteria femorale (FAL)
NOTA: Per indurre infiammazione sterile e arteriogenesi, sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J di 8-10 settimane. Nessuno dei topi è morto o ha so...

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	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

Il metodo descritto di analisi multifotonica in vivo del reclutamento dei leucociti rappresenta un'aggiunta agli strumenti comunemente usati per gli studi di reclutamento dei leucociti come le analisi istologiche (immuno-) o FACS. Con questo metodo di imaging, è possibile visualizzare in modo più dettagliato i processi dinamici nell'aderenza e nello stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi10. Nonostante il valore aggiunto di questo metodo, il protocollo offerto include alcuni pass...

Nonostante l'intenso interesse della ricerca negli ultimi anni, le malattie cardiovascolari, ad esempio la cardiopatia ischemica e l'ictus, sono ancora la principale causa globale di morte1. I trattamenti attuali per queste malattie sono terapie altamente invasive come l'angioplastica transluminale percutanea, l'angioplastica coronarica transluminale percutanea o la chirurgia di bypass2. Pertanto, è urgentemente necessario lo sviluppo di opzioni terapeutiche alternative e non invasive. Il corpo può creare bypass naturali attorno a un vaso stenosed o occluso per reindirizzare il flusso sanguigno interrotto alla parte distale della stenosi. Questo processo è chiamato arteriogenesi2. Molti studi recenti hanno dimostrato che l'aumento del taglio dei fluidi influisce sul reclutamento dei leucociti, che svolge un ruolo importante durante l'arteriogenesi3. Le principali opzioni attuali per analizzare il reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi sono le analisi istologiche ex vivo (immuno-) o la metodologia di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)4. Per consentire la valutazione della dinamica dei leucociti durante l'arteriogenesi, questo articolo presenta un protocollo di imaging intravitale con microscopia multifotonica.
I leucociti sono le principali cellule del sangue reclutate durante il processo di arteriogenesi3. Questo protocollo utilizza l'imaging multifotonico per mostrare il crawling di leucociti aderenti marcati con anticorpi anti-CD45-PE iniettati nelle arterie collaterali, 24 ore dopo l'induzione dell'arteriogenesi mediante legatura dell'arteria femorale (FAL) impiegando un'ischemia murina degli arti posteriori modello 5,6. In alternativa, le cellule immunitarie possono essere marcate ex vivo e iniettate con cura nei topi, come mostrato negli studi sull'angiogenesi utilizzando la microscopia intravitale7. Il flusso sanguigno all'interno dei vasi e delle arterie può essere visualizzato da CD41-FITC (per etichettare le piastrine), destrano-FITC (plasma) o dalla seconda generazione armonica (SHG), che visualizza il collagene di tipo 1 presente nella membrana basale di alcune parti dell'albero vascolare. SHG è un effetto unico di etichettatura libera dell'eccitazione multifotonica. L'imaging multifotonico consente il tracciamento cellulare a lungo termine senza danneggiare il tessuto e attivando le cellule mediante eccitazione di potenza laser. La microscopia multifotonica è il metodo di imaging scelto per visualizzare cellule e strutture marcate con fluorescenza in animali viventi grazie alla sua capacità di eccitare i fluorofori più in profondità nei tessuti / organi con una fototossicità minima8.
L'uso di laser a infrarossi sintonizzati con impulsi erogati entro intervalli di femtosecondi eccita il fluorocromo solo sul piano focale, senza eccitazione sopra e sotto il piano focale8. Pertanto, la microscopia multifotonica consente un'elevata risoluzione spazio-temporale, meno foto-danni e una maggiore penetrazione tissutale per lo studio di eventi biologici dinamici all'interno degli organi. È uno strumento di microscopia ideale per l'imaging di animali vivi. Tuttavia, il multifotone e qualsiasi altra arte della microscopia intravitale è limitata dal movimento dei tessuti a causa del battito cardiaco, della respirazione, dei movimenti peristaltici, della tonalità muscolare e di altre funzioni fisiologiche, che disturbano l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Poiché questi movimenti compromettono la risoluzione temporale e spaziale e talvolta impediscono persino analisi successive, devono essere affrontati in modo appropriato per consentire un'analisi e un'interpretazione accurate dei dati. Sono state sviluppate diverse strategie per ridurre o prevenire gli artefatti dal movimento dei tessuti. Questo protocollo applica un software di correzione della deriva in situ chiamato VivoFollow9 per correggere la deriva del tessuto durante l'acquisizione delle immagini. Questo approccio fornisce la stabilizzazione dell'immagine richiesta, consentendo l'imaging a lungo termine e l'analisi del tracciamento cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

L'arteriogenesi dipende fortemente dal reclutamento di leucociti e piastrine nello spazio perivascolare dei vasi collaterali in crescita. L'approccio standard per l'analisi delle arterie collaterali e dei leucociti nell'arteriogenesi è la metodologia istologica ex vivo (immuno-). Tuttavia, questa tecnica non consente la misurazione di processi dinamici come il flusso sanguigno, lo sforzo di taglio, le interazioni cellula-cellula e la velocità delle particelle. Questo articolo presenta un protocollo per monitorare i processi in vivo nelle arterie collaterali in crescita durante l'arteriogenesi utilizzando l'imaging intravitale. Il metodo qui descritto è uno strumento affidabile per la misurazione dinamica e offre un'analisi ad alto contrasto con fotocitotossicità minima, fornita dalla microscopia ad eccitazione multifotonica. Prima di analizzare le arterie collaterali in crescita, l'arteriogenesi è stata indotta nel muscolo adduttore dei topi mediante legatura unilaterale dell'arteria femorale.
Dopo la legatura, le arterie collaterali preesistenti hanno iniziato a crescere a causa dell'aumento dello stress da taglio. Ventiquattro ore dopo l'intervento, la pelle e il grasso sottocutaneo sopra le arterie collaterali sono stati rimossi, costruendo una tasca per ulteriori analisi. Per visualizzare il flusso sanguigno e le cellule immunitarie durante l'imaging in vivo , gli anticorpi CD41-fluoresceina isotiocianato (FITC) (piastrine) e CD45-ficoeritrina (PE) (leucociti) sono stati iniettati per via endovenosa (e.v.) tramite un catetere posto nella vena della coda di un topo. Questo articolo introduce l'imaging multifotonico intravitale come complemento alternativo o in vivo alle analisi istologiche statiche ex vivo (immuno-) comunemente utilizzate per studiare i processi rilevanti per l'arteriogenesi. In sintesi, questo articolo descrive un nuovo e dinamico metodo in vivo per studiare il traffico di cellule immunitarie, il flusso sanguigno e lo stress da taglio in un modello di arteriogenesi degli arti posteriori, che aumenta notevolmente le possibilità di valutazione.

La microscopia multifotonica offre un'elevata risoluzione spazio-temporale per il tracciamento dei leucociti, in cui le fasi di migrazione cellulare e la velocità possono essere monitorate e monitorate (Figura 4A,B). Tuttavia, il movimento fisiologico del campione rappresenta una sfida, specialmente per le acquisizioni di immagini di microscopia intravitale a lungo termine. Pertanto, una buona preparazione del tessuto e supporti per fissare il tessuto e strumenti, come la c...

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Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di analizzare il processo di arteriogenesi in vivo monitorando l'aderenza e lo stravaso delle cellule immunitarie nelle arterie collaterali in crescita in tempo reale. La tecnica di microscopia multifotonica consente la visualizzazione della dinamica cellulare nel tessuto profondo di modelli murini viventi con bassa fototossicità e con alta risoluzione spaziotemporale. La procedura al microscopio sarà dimostrata da Dominic van den Heuvel, un assistente tecnico della piattaforma di imaging multifotonico del laboratorio della dottoressa Helen Ishikawa-Ankerhold.Dimostrerò la procedura chirurgica. Per iniziare, posizionare il topo anestetizzato in posizione supina. Quindi posizionare due pezzi di argilla modellata sotto l'arto posteriore superiore del topo per garantire una posizione piana del muscolo adduttore.Posizionare il mouse sotto il microscopio stereo. Dopo aver rimosso i peli da entrambe le gambe, disinfettare e tagliare la pelle in un cerchio attorno alla cicatrice della precedente legatura dell'arteria femorale dell'arto posteriore destro. Rimuovere la pelle e lo strato di grasso dalla parte superiore della gamba e tirare da parte la pelle rimanente usando punti di sutura per creare una tasca attorno al muscolo adduttore con i vasi collaterali.Successivamente, rimuovere il grasso sottocutaneo per ottenere una visione chiara del muscolo adduttore, dell'arteria e della vena profonde, nonché dei vasi collaterali. Rimuovere lo strato muscolare superficiale sopra i vasi collaterali usando una pinza fine. Riempire la tasca preparata con soluzione salina per evitare che il tessuto si asciughi e continuare la stessa procedura per l'arto posteriore sinistro finto operato.Prima dell'imaging, aggiungere gel ad ultrasuoni in entrambe le tasche che impedisce l'asciugatura e funge da mezzo di immersione per l'accoppiamento ottico con l'obiettivo. Accendere la chiave della scatola laser in zaffiro di titanio, la scatola delle interfacce elettroniche, l'unità di riscaldamento della camera dell'incubatore, la lampada fluorescente e il computer. Avviare il software di acquisizione.Impostare la lunghezza d'onda a 800 nanometri e aprire l'otturatore del microscopio. Nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione, scegliere la modalità strumento come raggio singolo e la modalità di misurazione come timelapse di scansione 3D. Quindi trasferire il topo anestetizzato nella camera di incubazione preriscaldata del microscopio e posizionare l'area con il gel ad ultrasuoni direttamente a contatto con la lente frontale dell'obiettivo.Aprire l'otturatore del microscopio a epifluorescenza. Quindi scegliere un filtro adeguato o un'impostazione dicroica per la visualizzazione FTSE. Definire l'area di interesse seguendo il flusso sanguigno sotto l'illuminazione a epifluorescenza.Dopo aver portato l'area di interesse nel campo visivo centrale, chiudere l'otturatore del microscopio a epifluorescenza. Nella finestra di dialogo dello scanner XY, impostare i parametri richiesti per dimensioni dell'immagine, pixel, frequenza, media delle linee. Regolare la potenza del laser e impostare il guadagno del moltiplicatore fotografico per i canali verde, rosso e blu.Selezionare un obiettivo adeguato per l'imaging intravitale e le impostazioni di correzione della deriva. Definire l'intervallo della pila di immagini avviando la modalità di acquisizione dell'anteprima premendo il pulsante rosso nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione. Per ottenere buone immagini, definisci l'area e la struttura di interesse mettendo a fuoco.Durante l'osservazione dello schermo, cambia messa a fuoco spostando l'obiettivo fino a quando l'immagine scompare e impostala come zero. Impostate la posizione dell'obiettivo come ultima posizione nella direzione assiale. Quindi cambia la messa a fuoco nella direzione opposta spostando l'obiettivo verso il basso fino a quando l'immagine scompare di nuovo dallo schermo.Fare clic sul pulsante di arresto nell'angolo superiore sinistro della finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione e impostare la dimensione del passo su due micrometri. Scegliere l'asse Python come primo dispositivo asse nella finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione e selezionare Non attivare la modalità di salvataggio automatico. Quindi selezionare la casella di salvataggio automatico solo sull'asse temporale.Quindi, premere l'icona Python nella finestra dei dispositivi disponibili per aprire la finestra di dialogo Python. Nelle impostazioni dell'asse della finestra di dialogo Python, immettere le sezioni da e a, quindi immettere il numero di passaggi. Passare alla finestra di dialogo XYZ stage Z e ingrandire l'intervallo di scansione di 200 micrometri su entrambe le estremità.Per fare ciò, inserisci 200 micrometri all'inizio e inserisci meno 240 micrometri alla fine e l'intervallo verrà automaticamente impostato come meno 440 micrometri. Apri la finestra di dialogo front-end di VivoFollow. Avviare l'acquisizione delle immagini premendo la punta della freccia verde nell'angolo superiore sinistro della finestra di dialogo della procedura guidata di misurazione.Se si utilizza la correzione della deriva dinamica, cercare una finestra di dialogo per visualizzare la configurazione di correzione della deriva. Quindi imposta il canale di acquisizione utilizzato come riferimento di un punto di riferimento mobile. Immettete l'offset di correzione massimo in micrometri aggiunto alla prima e all'ultima posizione Z, quindi fate clic su OK. Monitorare l'offset di deriva corrente in X, Y e Z in tempo reale durante l'acquisizione dell'immagine nella finestra di dialogo front-end vivo flow e interrompere l'acquisizione dell'imaging dopo 35 minuti quando è necessario un altro ciclo di reiniezione di anestesia.Iniettare mezza dose della miscela MMF e riavviare l'acquisizione dell'imaging fino al termine dell'esperimento. Questo strumento consente l'acquisizione di immagini a lungo termine, consente la raccolta di dati di alta qualità ed è adatto per tracciare le celle per le misurazioni della velocità. Come mostrato senza correzione della deriva, la regione di interesse si allontana progressivamente dalla vista di registrazione, influenzando la capacità di tracciare le celle per l'analisi della velocità.Tuttavia, i filmati stabili possono essere registrati con il software di correzione della deriva e più celle possono essere monitorate per un lungo periodo. Il software di correzione della deriva può anche fornire una visualizzazione degli offset X, Y e Z nel tempo che è stato corretto dal sistema. La microscopia multifotonica offre un'elevata risoluzione spaziotemporale per il tracciamento dei leucociti in cui le fasi di migrazione cellulare e la velocità possono essere monitorate e monitorate.Preparando i vasi collaterali per l'imaging multifotonico, è essenziale evitare danni alle arterie collaterali. Prima dell'imaging, è importante identificare in modo sicuro l'arteria collaterale corretta. Con questa nuova procedura di imaging multifotonico intravitale delle arterie collaterali, è possibile analizzare l'aderenza e lo stravaso di tutte le cellule del sangue in vivo modificando l'etichetta dell'anticorpo.

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