Name: multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A / SM, proje Z01) tarafından finanse edildi. Dr. Susanne Stutte'ye makaleyi okuduğu için teşekkür ederiz.

Bu çalışma Bavyera Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (etik kodla onaylanmıştır: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Bu deneyler, Alman hayvan mevzuatı yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hayvanlar ve femoral arter ligasyonu (FAL)
NOT: Steril inflamasyon ve arteriyogenezi indüklemek için 8-10 haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Farelerin hiçbiri, sırasıyla FAL veya sahte ame...

<ol>
	<li>The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020)</li><li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+arteriogenesis.">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li><li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice.">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li><li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease.">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).</li><li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia.">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease.">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling.">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li></ol>

Lökosit alımının tarif edilen multifoton in vivo analizi yöntemi, (immüno-) histolojik veya FACS analizleri gibi lökosit işe alım çalışmaları için yaygın olarak kullanılan araçlara bir eki temsil etmektedir. Bu görüntüleme yöntemi ile arteriyogenez10 sırasında lökosit aderansı ve ekstravazasyonundaki dinamik süreçleri daha ayrıntılı olarak görselleştirmek mümkündür. Bu yöntemin katma değerine rağmen, sunulan protokol bazı kritik adımlar ve sınırla...

Son yıllardaki yoğun araştırma ilgisine rağmen, kardiyovasküler hastalıklar, örneğin iskemik kalp hastalığı ve inme, hala önde gelen küresel ölüm nedenidir1. Bu hastalıkların güncel tedavileri perkütan transluminal anjiyoplasti, perkütan transluminal koroner anjiyoplasti veya bypass cerrahisi2 gibi oldukça invaziv tedavilerdir. Bu nedenle, alternatif, non-invaziv tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Vücut, kesilen kan akışını stenozun distal kısmına yönlendirmek için stenozlu veya tıkalı bir damarın etrafında doğal baypaslar oluşturabilir. Bu sürece arteriyogenez2 denir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, artan sıvı kaymasının, arteriyogenez3 sırasında önemli bir rol oynayan lökosit alımını etkilediğini göstermiştir. Arteriyogenez sırasında lökositlerin işe alımını analiz etmek için ana güncel seçenekler ex vivo (immüno -) histolojik analizler veya floresan aktive hücre sıralama (FACS) metodolojisi4'tür. Arteriyogenez sırasında lökosit dinamiklerinin değerlendirilmesini sağlamak için, bu yazıda multifoton mikroskobu ile intravital bir görüntüleme protokolü sunulmaktadır.
Lökositler, arteriyogenez3 sürecinde işe alınan başlıca kan hücreleridir. Bu protokol, kollateral arterlerde enjekte edilen anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş yapışkan lökositlerin taranmasını, bir murin arka ekstremite iskemisi model 5,6 kullanılarak femoral arter ligasyonu (FAL) ile arteriyogenezin indüksiyonundan 24 saat sonra göstermek için multifoton görüntüleme kullanır. Alternatif olarak, bağışıklık hücreleri ex vivo olarak etiketlenebilir ve intravital mikroskopi7 kullanılarak anjiyogenez üzerine yapılan çalışmalarda gösterildiği gibi farelere dikkatlice enjekte edilebilir. Damarlar ve arterler içindeki kan akışı, CD41-FITC (trombositleri etiketlemek için), dekstran-FITC (plazma) veya vasküler ağacın bir kısmının bazal zarında bulunan kollajen tip 1'i görselleştiren ikinci harmonik nesil (SHG) ile görselleştirilebilir. SHG, çoklu foton uyarımının benzersiz bir serbest etiketleme etkisidir. Multifoton görüntüleme, dokuya zarar vermeden ve hücreleri lazer güç uyarımı ile aktive etmeden uzun süreli hücre takibine izin verir. Multifoton mikroskopisi, floroforları doku / organların derinliklerine minimum fototoksisite ile uyarma kabiliyeti nedeniyle canlı hayvanlarda floresan olarak etiketlenmiş hücreleri ve yapıları görselleştirmek için tercih edilen görüntüleme yöntemidir8.
Femtosaniye aralıklarla verilen darbelerle ayarlanmış kızılötesi lazerlerin kullanılması, florokromu yalnızca odak düzleminde heyecanlandırır, odak düzlemi8'in üstünde ve altında uyarma olmaz. Böylece, çoklu foton mikroskopisi, organların içindeki dinamik biyolojik olayları incelemek için yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük, daha az foto-hasar ve artan doku penetrasyon görüntülemesine izin verir. Canlı hayvan görüntülemesi için ideal bir mikroskopi aracıdır. Bununla birlikte, multifoton ve diğer intravital mikroskopi sanatları, kalp atışı, solunum, peristaltik hareketler, kas tonalitesi ve görüntüleme edinimini ve analizini bozan diğer fizyolojik fonksiyonlar nedeniyle doku hareketi ile sınırlıdır. Bu hareketler zamansal ve mekansal çözünürlüğü bozduğundan ve hatta bazen sonraki analizleri yasakladığından, doğru veri analizi ve yorumlamasını sağlamak için uygun şekilde ele alınmaları gerekir. Doku hareketinden kaynaklanan artefaktları azaltmak veya önlemek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. Bu protokol, görüntü alımı sırasında doku kaymasını düzeltmek için VivoFollow9 adlı bir yerinde sürüklenme düzeltme yazılımı uygular. Bu yaklaşım, gerekli görüntü sabitlemeyi sağlayarak uzun süreli görüntüleme ve hücre izleme analizine olanak tanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>309628</td>
			<td>syringe for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td>
			<td>3M, St. Paul, MN, USA</td>
			<td>1538-0</td>
			<td>fixation tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Zoetis, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6J mouse</td>
			<td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>used animals for surgery/imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-FITC ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>133904</td>
			<td>Platelet labeling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368510</td>
			<td>Leukocytes labelling in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfectant Cutasept</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td>
			<td>AK64.2</td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cream (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenile</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths medical</td>
			<td>Lot 278316</td>
			<td>0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl flexible</td>
			<td>BRAUM</td>
			<td>1050052</td>
			<td>tissue glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>version 9.2</td>
			<td>Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Imaging instrument</td>
			<td>Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA KL300 LED</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>light for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M60</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MC120 HD</td>
			<td>Leica, Solms, Germany</td>
			<td></td>
			<td>camera for microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscope</td>
			<td>Lavision</td>
			<td>TRIMScope II</td>
			<td>WL 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Deutschland</td>
			<td>3570310</td>
			<td>saline for pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naloxone</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td>
			<td></td>
			<td>antagonize anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 30 G</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>305128</td>
			<td>needle for i.v. catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided suture (0/7)</td>
			<td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td>
			<td>SUT-S&#160;103</td>
			<td>suture for femoral artery ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrason Gel</td>
			<td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td>
			<td>782012</td>
			<td>gel for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6.0 suture</td>
			<td>Vicryl, Johnson&#38;Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>NW-2347</td>
			<td>suture to build pocket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoFollow drift correction software</td>
			<td>Developed by Mykhailo Vladymyrov</td>
			<td></td>
			<td>Reference 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiphoton intravital imaging for monitoring leukocyte recruitment during arteriogenesis in a murine hindlimb model

Arteriyogenez, büyüyen kollateral damarların perivasküler boşluğuna lökosit ve trombosit alımına güçlü bir şekilde bağlıdır. Arteriogenezde kollateral arterlerin ve lökositlerin analizinde standart yaklaşım ex vivo (immüno -) histolojik metodolojidir. Bununla birlikte, bu teknik kan akışı, kayma stresi, hücre-hücre etkileşimleri ve parçacık hızı gibi dinamik süreçlerin ölçülmesine izin vermez. Bu yazıda, intravital görüntüleme kullanılarak arteriyogenez sırasında büyüyen kollateral arterlerde in vivo süreçleri izlemek için bir protokol sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntem, dinamik ölçüm için güvenilir bir araçtır ve çoklu foton uyarma mikroskobu tarafından sağlanan minimum foto-sitotoksisiteye sahip yüksek kontrastlı bir analiz sunar. Büyüyen kollateral arterleri analiz etmeden önce, femoral arterin tek taraflı bağlanması ile farelerin adduktör kasında arteriyogenez indüklendi.
Ligasyondan sonra, önceden var olan kollateral arterler, artan kayma stresi nedeniyle büyümeye başladı. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, kollateral arterlerin üzerindeki deri ve deri altı yağları çıkarıldı ve daha ileri analizler için bir cep oluşturuldu. İn vivo görüntüleme sırasında kan akışını ve bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için, CD41-floresein izotiyosiyanat (FITC) (trombositler) ve CD45-fikoeritrin (PE) (lökositler) antikorları, bir farenin kuyruk damarına yerleştirilen bir kateter aracılığıyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edildi. Bu makalede, arteriyogenez ile ilgili süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan statik ex vivo (immüno-) histolojik analizlere alternatif veya in vivo kompleman olarak intravital multifoton görüntüleme tanıtılmaktadır. Özetle, bu yazıda immün hücre kaçakçılığını, kan akışını ve kayma stresini arka bacak arteriyogenez modelinde araştırmak için yeni ve dinamik bir in vivo yöntem anlatılmakta ve bu da değerlendirme olanaklarını önemli ölçüde artırmaktadır.

Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir mekansal-zamansal çözünürlük sunar (Şekil 4A, B). Bununla birlikte, numunenin fizyolojik hareketi, özellikle uzun süreli intravital mikroskopi görüntü kazanımları için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, başarılı ve istikrarlı görüntüleme elde etmek için iyi bir doku hazırlığı ve dokuyu sabitlemek için t...

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model at JoVE.com

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Protokolümüz, araştırmacıların büyüyen kollateral arterlerde immün hücre aderansını ve ekstravazasyonunu gerçek zamanlı olarak izleyerek in vivo arteriyogenez sürecini analiz etmelerini sağlar. Multifoton mikroskopi tekniği, canlı fare modellerinin derin dokusundaki hücre dinamiklerinin düşük fototoksisiteye ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlüğe sahip olarak görselleştirilmesini sağlar. Mikroskop prosedürü, Dr. Helen Ishikawa-Ankerhold'un laboratuvarından multifoton görüntüleme platformundan teknik asistan Dominic van den Heuvel tarafından gösterilecek.Cerrahi prosedürü göstereceğim. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Ardından, adduktör kasının düzlemsel bir pozisyonunu sağlamak için farenin üst arka bacağının altına iki parça kalıplanmış kil yerleştirin.Fareyi stereo mikroskopun altına yerleştirin. Saçları her iki bacaktan çıkardıktan sonra, cildi sağ arka bacağın daha erken femoral arter ligasyonunun izi etrafındaki bir daire içinde dezenfekte edin ve kesin. Deri ve yağ tabakasını bacağın üstünden çıkarın ve kollateral damarlarla adduktör kasının etrafında bir cep oluşturmak için dikişler kullanarak kalan cildi bir kenara çekin.Daha sonra, adduktör kası, profunda arteri ve venin yanı sıra kollateral damarların net bir görünümünü elde etmek için deri altı yağını çıkarın. İnce forsepsler kullanarak kollateral damarların üstündeki yüzeysel kas tabakasını çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için hazırlanan cebi salinle doldurun ve sahte ameliyat edilen sol arka bacak için aynı prosedüre devam edin.Görüntülemeden önce, her iki cebe de kurumayı önleyen ve hedefle optik bağlantı için daldırma ortamı görevi gören ultrasonik jel ekleyin. Titanyum safir lazer kutusunun, elektronik arayüz kutusunun, inkübatör odasının ısıtma ünitesinin, floresan lambanın ve bilgisayarın anahtarını açın. Satın alma yazılımını başlatın.Dalga boyunu 800 nanometreye ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü açın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunda, cihaz modunu tek ışın ve ölçüm modunu 3B tarama hızlandırması olarak seçin. Daha sonra anestezi uygulanmış fareyi mikroskobun önceden ısıtılmış inkübasyon odasına aktarın ve ultrasonik jel ile alanı doğrudan objektif ön lensle temas halinde konumlandırın.Epifloresan mikroskop deklanşörünü açın. Ardından, FTSE görselleştirmesi için yeterli bir filtre veya dikroik ayar seçin. Epifloresan aydınlatma altında kan akışını takip ederek ilgi alanını tanımlayın.İlgilenilen alanı orta görüş alanına getirdikten sonra, epifloresan mikroskop deklanşörünü kapatın. XY tarayıcı iletişim kutusunda, görüntü boyutu, piksel, frekans, çizgi ortalaması için gerekli parametreleri ayarlayın. Lazer gücünü ayarlayın ve yeşil, kırmızı ve mavi kanallar için fotoğraf çarpanı kazancını ayarlayın.İntravital görüntüleme ve sürüklenme düzeltme ayarları için yeterli bir hedef seçin. Ölçüm sihirbazı iletişim penceresindeki kırmızı düğmeye basarak önizleme alma modunu başlatarak görüntü yığını aralığını tanımlayın. İyi görüntüler elde etmek için, odaklanarak ilgi alanını ve yapısını tanımlayın.Ekranı gözlemlerken, görüntü kaybolana kadar hedefi hareket ettirerek odağı değiştirin ve sıfır olarak ayarlayın. Hedef konumu eksenel yöndeki son konum olarak ayarlayın. Ardından, görüntü ekrandan tekrar kaybolana kadar hedefi aşağı doğru hareket ettirerek odağı ters yönde değiştirin.Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki durdur düğmesine tıklayın ve adım boyutunu iki mikrometre olarak ayarlayın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunda ilk eksen aygıtı olarak python eksenini seçin ve otomatik kaydetme modunu etkinleştirme'yi seçin. Ardından, otomatik kaydetme kutusunu yalnızca zaman ekseninde işaretleyin.Ardından, Python iletişim penceresini açmak için kullanılabilir cihazlar penceresindeki Python simgesine basın. Python iletişim kutusu ekseni ayarlarında, başlangıç ve bitiş bölümlerini girin, ardından adım sayısını girin. XYZ sahne Z iletişim penceresine gidin ve tarama aralığını her iki uçta da 200 mikrometre genişletin.Bunu yapmak için, başlangıçta 200 mikrometre girin ve sonunda eksi 240 mikrometre girin ve aralık otomatik olarak eksi 440 mikrometre olarak ayarlanacaktır. VivoFollow ön uç iletişim kutusunu açın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki yeşil ok ucuna basarak görüntü yakalamayı başlatın.Canlı sapma düzeltmesi kullanılıyorsa, sapma düzeltme yapılandırmasının görünmesi için bir iletişim kutusu arayın. Ardından, mobil yer işareti referansında olduğu gibi kullanılan edinme kanalını ayarlayın. İlk ve son Z konumlarına eklenen mikrometre cinsinden maksimum düzeltme ofsetini girin ve Tamam'ı tıklatın. Vivo akış ön uç iletişim penceresinde görüntü toplama sırasında X, Y ve Z'deki mevcut sapma ofsetini gerçek zamanlı olarak izleyin ve başka bir anestezi yeniden enjeksiyon döngüsü gerektiğinde 35 dakika sonra görüntüleme alımını durdurun.MMF karışımının yarım dozunu enjekte edin ve deney bitene kadar görüntüleme alımını yeniden başlatın. Bu araç uzun süreli görüntü yakalamaya izin verir, yüksek kaliteli veri toplamaya olanak tanır ve hız ölçümleri için hücreleri izlemek için uygundur. Sürüklenme düzeltmesi olmadan gösterildiği gibi, ilgilenilen bölge giderek kayıt görünümünden uzaklaşır ve hız analizi için hücreleri izleme yeteneğini etkiler.Bununla birlikte, sürüklenme düzeltme yazılımı ile kararlı filmler kaydedilebilir ve uzun bir süre boyunca daha fazla hücre izlenebilir. Sapma düzeltme yazılımı, sistem tarafından düzeltilen zaman içindeki X, Y ve Z ofsetlerinin görselleştirilmesini de sağlayabilir. Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir uzaysal zamansal çözünürlük sunar.Kollateral damarları çoklu foton görüntüleme için hazırlayarak, kollateral arterlerin zarar görmesini önlemek önemlidir. Görüntülemeden önce, doğru kollateral arteri güvenli bir şekilde tanımlamak önemlidir. Kollateral arterlerin intravital multifoton görüntülemesinin bu yeni prosedürü ile, antikor etiketini değiştirerek tüm kan hücrelerinin aderansını ve ekstravazasyonunu in vivo olarak analiz etmek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Restenoz Çalışmaları Karotis Arter Stent İmplantasyonu bir murin Modeli

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Akut ve Subakut Fare Arka ayağın İskemi Yöntemleri

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...