Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 HD093778 إلى E.B-F و T32 HD007065 إلى R.B). نشكر زاكاري باوتشر على مساعدته في التجربة الإشعاعية. نشكر ماري آن هاندل على قراءتها النقدية للمخطوطة. نحن نقدر بامتنان مساهمة سونيا إيراتوبوزا وخدمة الفحص المجهري الأساسية في مختبر جاكسون لمساعدة الخبراء في عمل الفحص المجهري الموصوف في هذا المنشور وجاريك ترابزو من خدمات الأدوات العلمية في مختبر جاكسون لتصميم شريحة المحول المطبوعة 3D.

كانت جميع الفئران المستخدمة من السلالة الوراثية C57BL/6J (انظر جدول المواد). تم تسلسل هذه السلالة بالكامل وهي قياسية للعديد من الدراسات حول بنية المبيض ووظيفته. تم إيواء الفئران وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة ، وتمت الموافقة على الإجراءات التي تم تنفيذها من قبل لجنة رعاية واستخ...

تقدم هذه المقالة بروتوكول تصوير وتصوير مناعي 3D مفصل للمبايض قبل الولادة وبعدها للحصول على إنتاجية عالية ودراسات مقارنة لتحديد كمية الخلايا الجرثومية وتوطين البروتين. قمنا بتطوير هذا البروتوكول لتحليل أعداد البويضات في المبيضين (N = 6-12) في ست نقاط زمنية للتطور في 10-16 سلالة مختلفة ، حيث تتم ?...

تولد معظم إناث الثدييات بعدد محدود من البويضات المتوقفة بشكل متوسط الحجم المخزنة داخل بصيلات بدائية ، والتي تشكل احتياطي المبيض (OR) 1,2. يحدد OR العمر الإنجابي العام للإناث والصحة3. عادة ما ينخفض حجم OR مع الشيخوخة ويمكن استنفاده قبل الأوان عند التعرض لبعض العوامل السامة للوراثية (الإشعاع / العلاج الكيميائي) والضغوط البيئية (سوء التغذية) ، مما يؤدي إلى العقم4،5،6. غالبا ما يمكن أن يعزى العقم الأنثوي مجهول السبب إلى الجودة الوراثية والفسيولوجية للبيض الذي يتطور من غرفة العمليات ولا يزال غير مفهوم بشكل جيد 7,8. نظرا لأن هبة الجريب الأنثوي محددة مسبقا إلى حد كبير بالولادة ، فمن الضروري فهم الآليات التنظيمية المشاركة في إنشاء OR وصيانتها.
في الفئران ، يبدأ تكوين OR بمواصفات الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) حول اليوم الجنيني (E) 7.52. تهاجر PGCs إلى التلال التناسلية ، حيث ستقيم بحوالي E10.59. يحدث الانتشار الواسع النطاق التالي مع الحركية الخلوية غير المكتملة مما يؤدي إلى تكوين الخراجات التي سيتم تقسيمها لاحقا في التطور10,11. في حوالي E12.5 ، يتم تحديد جنس الغدد التناسلية ، ويتوقف انتشار PGC في المبيضين. في الإناث ، تدخل PGCs ، البويضات الآن ، الطور الأولي الوسيط الأول (MPI) عند حوالي E13.512,13. تتقدم البويضات من خلال MPI الممتد والاعتقال في مرحلة الإملاء في وقت قريب من الولادة. خلال الأسبوع الأول بعد الولادة ، تحيط بكل بويضة تم القبض عليها خلايا حبيبية ، وبالتالي تشكل جريبا بدائيا.
يعتمد عدد البصيلات البدائية في OR للأنثى على عدد البويضات التي نجت من موجات التخلص من البويضات التي تحدث قبل وأثناء اعتقال MPI من خلال موت الخلايا المبرمج أو الالتهام الذاتي أو النخر14,15. تحدث الموجة الأولى أثناء نمو الجنين وتعرف باسم FOA. FOA هي عملية محفوظة تطوريا في الإناث (الثدييات وغير الثدييات) ، حيث يتم التخلص من ما يقدر بنحو 50-80٪ من البويضات اعتمادا على الأنواع الأنثوية16،17،18،19. في الفئران ، يحدث FOA خلال E15.5 إلى E18.5 وقد يعزى إلى إعادة تنشيط والتعبير عن تسلسلات LINE-1 retrotransposon مما تسبب في موت البويضات20,21. تحدث الموجة الثانية من التخلص من البويضات من خلال نقطة تفتيش meiotic تقضي على البويضات ذات العيوب الوسيطة مثل فواصل الحمض النووي المزدوجة التي لم يتم إصلاحها (DSBs) 22,23. تحدث الموجة التالية من التخلص من البويضات أثناء انهيار الكيس ، وتبلغ ذروتها أثناء تكوين بصيلات بدائية ، يحتوي كل منها على بويضة واحدة10،11،24،25.
في الفئران ، يتم إنشاء احتياطي الجريب البدائي إلى حد كبير بحلول سن البلوغ ، وبعد ذلك ينخفض مع تنشيط البصيلات البدائية للنمو خلال الدورات التناسلية العادية. يختلف حجم OR بين النساء الفرديات وبين السلالات الجينية المختلفة للفئران. ومع ذلك ، فإن التنظيم الجيني لحجم OR غير مفهوم جيدا26،27،28،29. ويعوق الدراسات الجينية لتنظيم OR عدم وجود بروتوكولات موحدة لدراسة موجات التخلص من البويضات أثناء تطور ما قبل الولادة وبعدها. تم تطوير العديد من منهجيات تكميم البويضات في الفئران ، وأكثرها شيوعا واستخداما على نطاق واسع هي التقييم النسيجي المورفومترية للأقسام النسيجية30،31. في هذه التقنية ، يتم تحديد البويضات على أقسام تسلسلية بها بقع نسيجية ، مثل الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وعلامات الحمض شيف الدورية (PAS) أو علامات الفلورسنت. هذه التقنية موثوقة إذا ظلت جميع الظروف ثابتة ، بما في ذلك سمك القسم ، والاسترداد الفعال لجميع الأقسام في جميع أنحاء المبيض ، ومخططات العد في المختبرات الفردية. ومع ذلك، فإن الأرقام التي تبلغ عنها المختبرات المختلفة غالبا ما تختلف اختلافا كبيرا، وبالتالي لا يمكن مقارنتها بسهولة.
علاوة على ذلك ، نظرا للاختلافات الجينية ، يمكن أن يؤثر استخدام سلالات الفئران المختلفة أيضا على عدد البويضات. تم تطوير مناهج حسابية إضافية للتقييم النسيجي وتشمل الكشف الآلي عن البويضات باستخدام نهج التجزئة ، والعد التلقائي باستخدام الخوارزميات الحسابية ، وإعادة بناء الصور النسيجية ثلاثية الأبعاد لمنع الأعداد المتعددة لنفس البويضة31،32،33،34،35،36 . حتى مع إضافة هذه التحسينات إلى التقييم النسيجي المورفومتري، فإن هذه التقنية كثيفة العمالة نسبيا، خاصة بالنسبة للدراسات واسعة النطاق وعالية الإنتاجية. قد لا تكون البيانات التي تم جمعها قابلة للتكرار وقابلة للمقارنة بين الدراسات بسبب الاختلافات في مخططات العد وخوارزميات الكمبيوتر والبرامج المستخدمة.
في الآونة الأخيرة ، تسارعت من خلال تطوير طرق جديدة متعددة الفوتونات والألواح الضوئية وطرق مسح الأنسجة البصرية متوسطة الدقة ، أصبحت تقنيات النمذجة والتحليل ثلاثية الأبعاد للمبايض السليمة هي الطريقة المفضلة لتحديد أعداد البويضات بكفاءة ودراسة توطين البروتين وديناميكياته37,38. هذه الطرق 3D عادة ما تكون مفيدة مقارنة بالطرق النسيجية حيث يتم الحفاظ على الأنسجة والأعضاء بشكل أفضل والحفاظ عليها سليمة. علاوة على ذلك ، يوفر تحليل 3D والنمذجة رؤى إضافية حول الوظيفة والتفاعلات داخل وبين منافذ الخلية أو الهياكل الفرعية داخل العضو التي قد يتم تفويتها في تحليل 2D.
يتطلب تحليل 3D للأعضاء بأكملها تحسين التثبيت ، والتلطيخ المناعي ، وبروتوكولات التطهير البصري للأعضاء الفردية ، مثل المبيضين ، دون تشويه الأنسجة أو تلفها. مطلوب تحسين إضافي لتركيب العينات للتصوير للفحص المجهري عالي الدقة وقد يعتمد على منصة التصوير المتاحة. وأخيرا، فإن تصوير المبيض السليم بأكمله يولد كمية كبيرة من البيانات للتحليلات الحسابية اللاحقة. لذلك ، هناك حاجة لتطوير طرق 3D موحدة لعد البويضات للدراسات المقارنة وعبر مراحل النمو.
يستخدم هذا البروتوكول بروتوكولات التطهير المناعي القياسية والمقاصة التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، مع التركيز على نهج بسيط وسهل الاستخدام وعالي الإنتاجية38،39،40،41. تم تحسين البروتوكول لتحليل أعداد كبيرة من المبايض قبل الولادة وبعدها حتى اليوم 28 بعد الولادة (P28) وأحجام مختلفة من المبيضين من خلفيات وراثية مختلفة للفئران. خطوات تلطيخ المناعة متشابهة لجميع المراحل. ومع ذلك ، تختلف بروتوكولات المقاصة بالنسبة لمبايض البلوغ بسبب حجمها الأكبر ، ScaleS4 (0) و CUBIC للمبايض الصغيرة والكبيرة ، على التوالي40,41. علاوة على ذلك ، يتم إجراء تروية الجسم بالكامل في الفئران P28 قبل التثبيت لمنع التألق الذاتي من خلايا الدم. تم بناء مجهر متعدد الفوتونات على منصة Leica DIVE/4Tune كبديل للفحص المجهري الضوئي للحصول على الصور ، وتم اختيار برنامج IMARIS 3D Visualization and Analysis مع أدوات تحليلية مختلفة لهذا البروتوكول. هذا البروتوكول سهل المتابعة وأقل عملية ، وبالتالي توفير الوقت. علاوة على ذلك ، فإن تحديد كمية البويضات سريع نسبيا ، اعتمادا على حجم المبيض وترتيب البويضات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

تعتمد خصوبة الإناث والعمر التناسلي على نوعية وكمية احتياطي بويضة المبيض. يتم التخلص من ما يقدر بنحو 80٪ من الخلايا الجرثومية الأنثوية التي تدخل الطور الأولي الاختزالي خلال استنزاف بويضة الجنين (FOA) والأسبوع الأول من حياة ما بعد الولادة. ثلاث آليات رئيسية تنظم عدد البويضات التي تعيش أثناء التطور وتنشئ احتياطي المبيض لدى الإناث اللواتي يدخلن سن البلوغ. في الموجة الأولى من فقدان البويضات ، يتم التخلص من 30-50٪ من البويضات خلال FOA المبكر ، وهي ظاهرة تعزى إلى التعبير العالي عن العنصر النووي الطويل المتخلل 1 (LINE-1). الموجة الثانية من فقدان البويضات هي القضاء على البويضات ذات العيوب الوسيطة بواسطة نقطة تفتيش جودة meiotic . تحدث الموجة الثالثة من فقدان البويضات في الفترة المحيطة بالولادة أثناء تكوين الجريب البدائي عندما تفشل بعض البويضات في تكوين بصيلات. ولا يزال من غير الواضح ما الذي ينظم كل من هذه الموجات الثلاث من فقدان البويضات وكيف تشكل احتياطي المبيض في الفئران أو البشر.
وقد فتح التألق المناعي والتصور 3D طريقا جديدا لتصوير وتحليل تطور البويضات في سياق المبيض بأكمله بدلا من أقسام 2D أقل إفادة. توفر هذه المقالة بروتوكولا شاملا للتلطيخ المناعي للمبيض بالكامل والمقاصة البصرية ، مما يؤدي إلى استعدادات للتصوير باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتونات والنمذجة 3D باستخدام البرامج المتاحة تجاريا. يوضح كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإظهار ديناميكيات استنزاف البويضات أثناء تطور المبيض في الفئران C57BL/6J وتحديد كمية فقدان البويضات خلال الموجات الثلاث للقضاء على البويضات. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مبايض ما قبل الولادة وبعدها المبكر لتصور البويضات وتحديدها كميا ، بالإضافة إلى النهج الكمية الأخرى. الأهم من ذلك ، تم تطوير البروتوكول بشكل استراتيجي لاستيعاب المعالجة عالية الإنتاجية والموثوقة والقابلة للتكرار التي يمكن أن تلبي الاحتياجات في علم السموم والتشخيص السريري والفحوصات الجينومية لوظيفة المبيض.

يتيح التلطيخ المناعي وتصوير المبيض بأكمله تصور وقياس حجم البويضات أو تعبير البروتين في المبيضين في مراحل النمو المختلفة باستخدام نفس التقنية والعلامات (الشكل 3). تم تطوير هذا البروتوكول لمشروع واسع النطاق يتطلب تحليل المبيضين على مراحل متعددة ومن سلالات متعددة من الفئران...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لتصوير المبايض بأكملها للتحليلات الكمية والنوعية باستخدام تلطيخ المناعة الكامل ، والمجهر متعدد الفوتونات ، والتصور والتحليل 3D. يستوعب هذا البروتوكول معالجة عالية الإنتاجية وموثوقة وقابلة للتكرار تنطبق على علم السموم والتشخيص السريري والمقايسات الجينومية لوظيفة المبيض.

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أحد الأسئلة الرئيسية في المجال التناسلي ، وهو كيف ومتى تؤثر العمليات المنظمة وراثيا على حجم احتياطي المبيض الذي نعرفه يؤثر على الإناث ، طول العمر التناسلي يمكن اعتماد هذا البروتوكول للدراسات واسعة النطاق باستخدام نفس التقنيات للمبايض السليمة من مراحل النمو المختلفة. يولد بيانات قابلة للإنتاج من خلال توفير قياس كمي فعال للخلايا الجرثومية. هذه الطريقة المطبقة على الحيوانات المتنوعة وراثيا من نفس النوع يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على العوامل الوراثية مباشرة تطور الخلايا الجرثومية والمبيض وغيرها من أعضاء التنمية.سيوضح الإجراء ناثانيل بوشات ، وهو متدرب أبحاث من مختبري للبدء بمكان خطوة الغزير وتأمين فأر البلوغ المخدر على ظهره عن طريق تثبيت جميع الساقين بلطف من خلال منصات المخلب في وضع مريح على لوحة. لفتح التجويف الصدري للفأر ، قم بقص الأضلاع بعناية على جانبي القص أسفل الكتف مباشرة ، وتجنب ثقب الرئتين ، وأمسك الجلد أو اللوحات الضلعية بالملقط وقم بتثبيت اللوحات لفضح الأعضاء الداخلية استخدم مقص التشريح لقص الأذين الأيمن للقلب وإطلاق الدم من النظام. ثم عن طريق إمساك القلب بالملقط ، أدخل إبرة تروية في البطين الأيسر وضخ 10 ملليلتر من PBS بضغط لطيف وثابت.عندما تتحول الأنسجة مثل الكلى الكبد والجهاز التناسلي من اللون الوردي إلى الأبيض ، استبدل PBS ب 1٪ من بارافورمالدهيد أو PFA الطازج واستمر في التروية بحوالي 10 ملليلتر من PFA. بعد ذلك ، حدد موقع وسادة الدهون مع المبيضين أسفل الكلى وتشريح الجهاز التناسلي بأكمله بلطف بما في ذلك المبيضين وسادة الدهون وقرون الرحم لوضعها في قارورة مع 4٪ PFA. ثبت المبيضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 إلى 24 ساعة قبل استبدال 4٪ PFA ب 70٪ إيثانول.في يوم تلطيخ تقليم المبيضين قبل الشروع في تلطيخ المناعة. في اليوم الأول من بروتوكول تلطيخ المناعة ماصة ملليلتر واحد من PBS لكل بئر في العدد المطلوب من الآبار في لوحة نظيفة 24 بئر. اقطع طرف ماصة 1000 ميكرولتر لعمل فتحة واسعة واستخدم الطرف العريض لنقل مبايض البلوغ بلطف من قوارير تحتوي على 70٪ إيثانول إلى الآبار ، ثم استبدل PBS في البئر ب 0.8 ملليلتر طازج من PBS في اليوم التالي استنشق PBS من الآبار لاستبداله ب 0.8 ملليلتر من المخزن المؤقت للنفاذية لكل بئر.بعد احتضان الألواح الموجودة على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، استبدل المخزن المؤقت للنفاذية بمخزن مؤقت مانع في اليوم الثالث ، قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخفيف في المخزن المؤقت للحظر. لتصور البويضات احتضان المبيضين قبل الولادة وقبل البلوغ مع علامات البويضات. في اليوم الثامن ، اغسل العينات بمخزن مؤقت جديد للغسيل لمدة ساعتين ثم استبدل مخزن الغسيل المؤقت ب 0.5 ملليلتر من خلطات الأجسام المضادة الثانوية المخففة في مخزن مؤقت مانع.أغلق اللوحة باستخدام بارافيلم لمنع التبخر واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاثة أيام. في اليوم 11 بعد غسل التلطيخ المناعي ، قم بشفط المخزن المؤقت للغسيل واحتضن العينات ب 0.8 ملليلتر من محلول واحد مكعب على مقياس عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام في الظلام. تغيير المقياس المكعب بمحلول واحد يوميا.في اليوم 15 ، اغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق و 0.8 ملليلتر من PBS في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. ثم استبدل PBS ب 0.8 ملليلتر من السكروز 20٪ المنزوع الغاز الطازج مع PBS متبوعا باهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، استبدل محلول السكروز 20٪ لمعالجة العينات ب 0.8 ملليلتر من محلول مكعب المقياس لمدة أربعة إلى خمسة أيام ، كما هو موضح سابقا.لإعداد عينة ، استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف لنقل مبايض البلوغ مع 15 إلى 20 ميكرولتر من محلول مكعب الحجم إلى منتصف البئر اللاصقة. بمجرد نقل المبيضين إلى البئر الفردي مع قطرة من محلول المقاصة ، ضع بلطف زجاج غطاء على البئر اللاصق واضغط لإنشاء ختم يمسح العينات ومحلول التطهير بين زلتين للغطاء. لمكان التصوير ، شطيرة انزلاق الغطاء في شريحة محول المجهر المطبوعة 3D.قم بإعداد المعلمات للحصول على الصور وفقا لنوى الفحص المجهري أو مواصفات الشركة المصنعة. إذا كان ذلك متاحا، فاستخدم الحصول على الصور ثنائي الاتجاه لتقليل وقت المسح الضوئي وتحسين الكفاءة. اضبط متوسط الخط ومتوسط الإطار وتراكم الإطار في البرنامج.قم بإعداد مكدس Z عن طريق تحديد موضع البداية والنهاية، ثم حدد حجم خطوة Z من ميكرومترين للمبيض قبل البلوغ وخمسة ميكرومترات للمبايض البلوغ. بعد ذلك ، قم بتنشيط ميزة تعويض Z وكسب الإثارة. اضبط تعويض Z لأسفل العينة وأعلاها عن طريق تحديد كثافة ليزر لكليهما.استخدم وضع التجانب للعينات الأكبر التي لا يمكن التقاطها في مجال رؤية واحد. قم بتنشيط متصفح الصور والإشارة إلى عدد البلاطات اللازمة لالتقاط العينة بأكملها باستخدام أداة وضع العلامات المستطيلة. بمجرد الانتهاء من الإعداد ، ابدأ بالحصول على الصورة للصور ذات البلاطات المتعددة ، وابدأ في الحصول على الصورة باستخدام المستكشف لالتقاط جميع البلاطات.بعد الحصول على الصورة، احفظ جميع الصور. وإذا تم الحصول على تجانبات متعددة، فقم بتشغيل أداة الفسيفساء المدمجة لدمج البلاط في صورة واحدة. لتحديد حجم البويضات، افتح الصورة وحدد خيار الشريحة لفتح صورة مكدس Zs.حدد خيار الخط ولوحة القياس وقم بقياس المسافة عن طريق رسم خط من حافة واحدة من البويضات أو العلامة إلى الحافة الأخرى في أوسع نقطة لتحديد قطر X Y للبويضة. تحرك عبر المكدس واحصل على نطاق الأقطار لبويضات متعددة من نفس النوع. استخدم أقصر طول كمعيار لاختيار الحجم لعدد البويضات.بعد ذلك ، في خيار عرض 3D ، حدد ميزة البقع. في لوحة المشهد ، قم بتنشيط وظيفة إضافة بقع جديدة لفتح لوحة الخوارزمية. ثم قم بإلغاء تحديد جميع إعدادات الخوارزمية كمرشح اختيار الحجم مع حجم البويضات الذي تم الحصول عليه مسبقا.انقر على سهم القناة للأمام للانتقال إلى القناة المصدر. ثم حدد القناة ذات العلامة المفضلة واكتب القطر المكتسب في قطر X و Y المقدر. بعد تحديد الحجم ، قم بتنشيط استطالة PSF النموذجية وطرح الخلفية التي يتم تحديدها تلقائيا.ثم، اختر السهم الأمامي الوحيد للانتقال إلى لوحة بقع التصفية وأضف مرشح الجودة لتحديد عتبة. لضمان التقدير الدقيق لأعداد البويضات تكبير الصورة. في وقت لاحق ، انقر فوق السهم المزدوج لإنهاء العد التلقائي.استخدم علامة التبويب تحرير لتحديد البويضات الفائتة يدويا أو إلغاء تحديد جزيئات غير البويضة المحددة بواسطة العتبة التلقائية. عند الانتهاء، قم بتسجيل البيانات في علامة التبويب الإحصاءات ضمن علامة التبويب العامة لمزيد من التحليل. لتقدير إجمالي أعداد البويضات والمبيضين التالفين ، افتح صورا للمبايض السليمة باستخدام MRS وحدد ميزة الإطار.ضمن إعدادات الإطار، حدد علامات اختيار شبكة المربع وتسميات الوصول. في الموضع علامة التبويب XYZ حدد 200 ميكروم لإنشاء علامات التجزئة مع 200 ميكرومتر من المسافات في جميع مواضع XYZ. باستخدام علامات التجزئة 200 ميكرومتر ، حدد البويضات التي تقع ضمن 50٪ من حجم كل مبيض.انقر على ميزة البقع وحدد تسميات التحرير لتصنيف البويضات التي تقع ضمن منطقة 50٪ حسب اللون. في التدرج الرمادي التمثيلي ، يمكن رؤية صور الفوتون المتعددة للمبايض غير المندمجة وغير المنصهرة ، والبويضات الصغيرة في البصيلات البدائية مع الطبقة الرقيقة من تلطيخ DDX4 السيتوبلازمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم رصد البويضات الأكبر داخل البصيلات المتنامية.تمت دراسة عروض 3D من صور الفوتون المتعددة للمبايض قبل الولادة وما بعد الولادة. في اليوم 28 بعد الولادة ، احتوى المبيض من الأنثى غير المشععة على مجموعة كبيرة من البويضات الصغيرة في البصيلات البدائية. في المقابل ، كان المبيضان من الأنثى المشععة مع 0.5 رمادي من إشعاع غاما خاليا تماما من البويضات الصغيرة في البصيلات الأولية.لكن البويضات الأكبر كانت لا تزال موجودة. من أجل تحديد كمية البويضات ، تمت معالجة صور الفوتون المتعدد 3D في برنامج MRS باستخدام مرشح goucian وتم تحديد البويضات ذات الأحجام الصغيرة والكبيرة وتحديدها كميا باستخدام ميزة البقعة. بعد ذلك ، تم حساب متوسط النسبة المئوية للبويضات في كل مرحلة مقارنة بمتوسط العدد الموجود في المرحلة المبكرة E 15.5 انخفضت أعداد البويضات بشكل حاد بين E 15.5 و E 18.5 و E 15.5 و E 18.5 البويضات الجنينية عبرت عن الخط الأول orf واحد P كما هو موضح في صور الفوتون المتعدد.أظهر تحليل الكثافة تعبيرات أعلى للخط الأول أو واحد P لكل بويضات عند E 18.5 من E 15.5. يمكن استخدام المبيضين ذوي الأضرار الصغيرة للتحليل. يتم تحديد إجمالي أعداد البويضات باستخدام التصحيح الحسابي.يظهر النموذج التمثيلي بويضات G CNA الإيجابية في مبيض E 15.5 مع خمس مناطق بنسبة 10٪ مميزة في مبيض سليم. وبالمثل ، تم إنشاء مبيض محاكاة مع مناطق متزايدة بنسبة 10٪ تفتقد ما يصل إلى 50٪ من المبيض. تمت مقارنة إجمالي أعداد البويضات والمبيضين المحاكيين بالمبيضين الأصليين السليمة.وتم تقديم الفرق على أنه النسبة المئوية للانحراف يؤدي التروية الجيدة إلى جودة صورة جيدة. لذا تأكد من تنظيف جميع الأنسجة باستخدام PBS قبل التبديل إلى PFA. تأكد من أن المبيضين مكشوفان تماما عن طريق تقليم الأنسجة الإضافية.يسمح البروتوكول بالتحليل الفعال لعدد كبير من العينات ، والبيانات الكمية التي تم الحصول عليها من المجموعات المرجعية الجينية مثل المخرجات التعاونية المتقاطعة أو المتنوعة ستساعد في تحديد المعدلات الجينية لتطوير البويضات وأعداد البويضات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...