Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
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这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（R01 HD093778至E.B-F和T32 HD007065至R.B）。）。我们感谢Zachary Boucher对辐射实验的帮助。我们感谢玛丽·安·亨德尔（Mary Ann Handel）对手稿的批判性阅读。我们非常感谢Sonia Erattupuzha和杰克逊实验室的显微镜核心服务部门在本出版物中描述的显微镜工作方面的专家协助，以及杰克逊实验室科学仪器服务的Jarex Trapszo设计3D打印适配器载玻片。

所有使用的小鼠都是遗传菌株C57BL / 6J（见 材料表）。该菌株已经过完全测序，是许多卵巢结构和功能研究的标准。根据NIH指南饲养小鼠，并且执行的程序由杰克逊实验室的机构动物护理和使用委员会批准。该方案中使用的试剂和组合物分别列在 材料表 和 表1中。
1. 试剂的制备
<ol><li>固定剂：在1x PBS中制备4%多聚甲醛（PFA）。例如，对?...

本文介绍了产前和产后卵巢的详细3D免疫染色和成像方案，用于生殖细胞定量和蛋白质定位的高通量和比较研究。我们开发了这个方案来分析卵巢中10-16个不同菌株的六个发育时间点的卵巢中的卵母细胞数量（N = 6-12），其中2-4个24孔板通常一次处理。这种方法可以适用于其他器官或细胞标志物。例如，该协议可用于标记和可视化体细胞，例如卵巢中的颗粒细胞，使用适当的抗体，从而促进体细胞 -...

大多数哺乳动物雌性出生时就储存在原始卵泡内的微粒停滞卵母细胞数量有限，构成卵巢储备（OR）1，2。手术室决定了女性的总体生殖寿命和健康状况3.手术室通常随着年龄的增长而减小，并且在暴露于某些遗传毒性药物（放疗/化疗）和环境压力（营养不良）时可能会过早耗尽，从而导致不孕症4，5，6。特发性女性不育症通常可归因于从手术室发育的卵子的遗传和生理质量，并且仍然知之甚少7，8。由于女性卵泡禀赋在很大程度上是由出生预先确定的，因此了解手术室建立和维护所涉及的调节机制至关重要。
在小鼠中，OR的形成始于胚胎日（E）7.5 2左右原始生殖细胞（PGCs）的规格。PGCs迁移到生殖器脊，在那里它们将大约在E10.59之前居住。以下广泛的增殖发生在细胞分裂不完全的情况下，导致囊肿的形成，这些囊肿将在发育的后期被分解10，11。在大约E12.5时，确定性腺性别，卵巢中的PGC增殖停止。在女性中，PGC（现在是卵母细胞）以大约E13.512，13进入减数分裂前期I（MPI）。卵母细胞通过延长的MPI进展，并在出生时左右的口述阶段停止。在出生后的第一周，每个停滞的卵母细胞被颗粒细胞包围，从而形成原始卵泡。
女性手术室中原始卵泡的数量取决于有多少卵母细胞在MPI停滞之前和期间通过细胞凋亡，自噬或坏死发生的卵母细胞消除波中幸存下来14，15。第一波发生在胎儿发育过程中，被称为FOA。FOA是雌性（哺乳动物和非哺乳动物）的进化保守过程，估计有50-80%的卵母细胞被消除，这取决于雌性物种16，17，18，19。在小鼠中，FOA发生在E15.5至E18.5期间，并且已被归因于逆转录转座子LINE-1序列的再激活和表达导致卵母细胞死亡20，21。第二波卵母细胞消除通过减数分裂检查点发生，该检查点消除具有减数分裂缺陷的卵母细胞，例如未修复的DNA双链断裂（DSBs）22，23。下一波卵母细胞消除发生在囊肿分解期间，在原始卵泡形成过程中达到高潮，每个卵泡含有单个卵母细胞10，11，24，25。
在小鼠中，原始卵泡储备主要由青春期建立，之后随着原始卵泡在常规生殖周期中被激活而减少生长。OR大小因个体女性和小鼠的不同遗传菌株而异;然而，OR大小的遗传调控尚未得到很好的理解26，27，28，29。由于缺乏研究产前和产后发育过程中卵母细胞消除波的标准化方案，手术室调控的遗传学研究受到阻碍。已经在小鼠中开发了几种卵母细胞定量方法，其中最常见和最广泛使用的是组织学切片的组织形态学评估30，31。在这种技术中，卵母细胞在具有组织学染色的连续切片上被鉴定，例如苏木精和eosin（H&E）以及高碘酸 - 希夫（PAS）或荧光标记物。如果所有条件保持不变，包括切片厚度，整个卵巢所有切片的有效恢复以及各个实验室的计数方案，则该技术是可靠的。然而，不同实验室报告的数字往往有很大差异，因此不容易比较。
此外，鉴于遗传差异，使用不同的小鼠菌株也会影响卵母细胞计数。已经开发了用于组织形态学评估的其他计算方法，包括使用分馏器方法自动检测卵母细胞，使用计算算法自动计数和组织学图像的3D重建以防止同一卵母细胞的多个计数31，32，33，34，35，36.即使将这些改进添加到组织形态学评估中，该技术也是相对劳动密集型的，特别是对于大规模和高通量研究。由于计数方案，计算机算法和所用软件的差异，收集的数据在研究之间可能无法重复和可比。
最近，随着新型中分辨率多光子和光片显微镜和光学组织清除方法的发展，完整卵巢的3D建模和分析技术正在成为有效量化卵母细胞数量和研究蛋白质定位和动力学的首选方法37，38。与组织学方法相比，这些3D方法通常是有利的，因为组织和器官可以更好地保存并保持完整。此外，3D分析和建模提供了对细胞内和器官内细胞壁龛或亚结构内的功能和相互作用的额外见解，这些功能和相互作用在2D分析中可能会遗漏。
整个器官的 3D 分析需要优化单个器官（如卵巢）的固定、免疫染色和光学清除方案，而不会发生组织变形或损伤。高分辨率显微镜需要对成像样品安装进行额外优化，并且可能取决于可用的成像平台。最后，整个完整卵巢的成像为后续的计算分析生成了大量数据。因此，有必要开发标准化的3D方法来计数卵母细胞，以进行比较研究和跨发育阶段。
该协议使用标准的免疫染色和先前报告的清除协议，专注于简单，用户友好和高通量的方法38，39，40，41。该方案经过优化，可分析大量产前和产后卵巢，直至产后第28天（P28）以及来自不同小鼠遗传背景的不同大小的卵巢。免疫染色步骤对于所有阶段都是相似的;然而，青春期卵巢的清除方案不同，因为它们的大小较大，小卵巢和大卵巢的ScaleS4（0）和CUBIC分别为40，41。此外，在固定前在P28小鼠中进行全身灌注，以防止血细胞的自发荧光。在徕卡DIVE/4Tune平台上构建了一台多光子显微镜，作为光片显微镜的替代方案来获取图像，并且为该协议选择了带有各种分析工具的IMARIS 3D可视化和分析软件。该协议易于遵循，较少的动手操作，因此节省了时间。此外，卵母细胞定量相对较快，这取决于卵巢的大小和卵母细胞的排列。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

女性的生育能力和生育寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，进入减数分裂前期I的女性生殖细胞中有80%在胎儿卵母细胞损耗（FOA）和产后第一周被消除。三种主要机制调节发育过程中存活的卵母细胞数量，并在进入青春期的女性中建立卵巢储备。在第一波卵母细胞丢失中，30-50%的卵母细胞在早期FOA期间被消除，这种现象归因于高长穿插核元素-1（LINE-1）表达。卵母细胞丢失的第二波是通过减数分裂质量检查点消除具有减数分裂缺陷的卵母细胞。第三波卵母细胞丢失发生在围产期，发生在原始卵泡形成期间，当时一些卵母细胞未能形成卵泡。目前尚不清楚是什么调节了这三波卵母细胞丢失中的每一波，以及它们如何塑造小鼠或人类的卵巢储备。
免疫荧光和3D可视化为在整个卵巢的背景下而不是在信息较少的2D部分中对卵母细胞发育进行成像和分析开辟了一条新的途径。本文为整个卵巢免疫染色和光学清除提供了全面的方案，产生了使用多光子显微镜成像和使用市售软件进行3D建模的准备工作。它展示了如何使用该方法来显示C57BL / 6J小鼠卵巢发育过程中卵母细胞损耗的动力学，并量化三波卵母细胞消除期间的卵母细胞丢失。该方案可应用于产前和产后早期卵巢，用于卵母细胞可视化和定量，以及其他定量方法。重要的是，该方案经过战略性开发，以适应高通量，可靠和可重复的处理，可以满足毒理学，临床诊断和卵巢功能基因组测定的需求。

整个卵巢的免疫染色和成像可以使用相同的技术和标记物对卵巢中不同发育阶段的卵母细胞或蛋白质表达进行可视化和定量（图3）。该协议是为一个大型项目开发的，该项目需要在多个阶段和多个小鼠品系中分析卵巢。在这里，我们介绍了为C57BL6 / J菌株收集的数据，C57BL6 / J菌株是用于遗传分析的标准菌株。这里介绍的技术很简单，可以在14-19天内获得结果（<strong class="xfig"...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

在这里，我们提出了一种优化的方案，用于对整个卵巢进行成像，以使用全装载免疫染色，多光子显微镜以及3D可视化和分析进行定量和定性分析。该方案适用于高通量、可靠和可重复的处理，适用于毒理学、临床诊断和卵巢功能的基因组测定。

全卵巢免疫荧光、清除和多光子显微镜用于小鼠发育中卵巢储备的定量3D分析

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

这种方法可以帮助回答生殖领域的一个关键问题，即遗传调节过程如何以及何时影响卵巢储备的大小，我们知道卵巢储备的大小会影响女性，生殖寿命该方案可以用于大规模研究，使用相同的技术对来自不同发育阶段的完整卵巢。它通过提供生殖细胞的有效定量来生成可生成的数据。这种方法应用于同一物种的遗传多样性动物可以提供直接遗传因素和生殖细胞发育等发育器官的洞察。来自我实验室的研究实习生Nathaniel Boechat将展示该程序，从丰富的步骤开始，并通过以放松的位置将所有腿通过爪垫轻轻地固定在板上，将麻醉的青春期雌性小鼠固定在其背部。要打开小鼠的胸腔，小心地切开肩胛骨正下方胸骨两侧的肋骨，避免刺穿肺部，用镊子抓住皮肤或肋骨瓣，并用夹住皮瓣以暴露内脏，使用解剖剪刀剪断心脏的右心房并从系统中释放血液。然后用镊子握住心脏，将灌注针插入左心室，并以温和恒定的压力泵送10毫升PBS。当肝脏肾脏和生殖道等组织从粉红色变为白色时，用新鲜制作的1%多聚甲醛或PFA代替PBS，并继续灌注约10毫升PFA。接下来，将带有卵巢的脂肪垫定位在肾脏下方，并轻轻解剖整个生殖道，包括脂肪垫卵巢和子宫角，将其放入具有4%PFA的小瓶中。在室温下固定卵巢16至24小时，然后用70%乙醇替换4%PFA。在染色当天修剪卵巢，然后进行免疫染色。在免疫染色方案的第一天，将每孔一毫升PBS移液到清洁的24孔板中所需数量的孔中。切下1000微升移液器吸头的尖端以形成宽开口，并使用宽尖端将带有70%乙醇的小瓶中轻轻地将青春期卵巢转移到孔中，然后用新鲜的0.8毫升PBS替换孔中的PBS第二天从孔中吸取PBS以每孔0.8毫升渗透缓冲液代替它。在室温下将板在振荡器上孵育四小时后，用封闭缓冲液替换渗透缓冲液在第三天，通过在封闭缓冲液中稀释来制备一抗。可视化卵母细胞将产前和青春期前卵巢与卵母细胞标志物一起孵育。在第八天用新鲜的洗涤缓冲液洗涤样品两小时，然后用0.5毫升在封闭缓冲液中稀释的二抗混合物替换洗涤缓冲液。用parafilm密封板以防止蒸发，并将样品在室温下在黑暗中孵育三天。在免疫染色洗涤后的第11天，吸出洗涤缓冲液，并将样品与0.8毫升刻度立方一溶液在37摄氏度下在黑暗中孵育三天。每天更换比例立方一溶液。在第15天，在室温下洗涤样品三次10分钟和0.8毫升PBS，轻轻摇动。然后用0.8毫升新鲜制备的脱气20%蔗糖用PBS代替PBS，然后在室温下轻轻摇动。如前所述，一小时后，更换20%蔗糖溶液，用0.8毫升立方二溶液处理样品四至五天。为了准备样品设置，使用带有尖端截止的200微升移液器吸头将带有15至20微升刻度立方二溶液的耻骨卵巢转移到粘合剂孔的中间。一旦卵巢被转移到单个孔中，用一滴清除溶液轻轻地将盖玻片放在粘合剂孔上并按压以形成一个密封，将样品和清除溶液夹在两个盖玻片之间。对于成像场所，盖子将三明治夹在3D打印的显微镜适配器载玻片中。根据显微镜芯或制造商的规格设置图像采集参数。如果可用，请使用双向图像采集来减少扫描时间并提高效率。在软件中调整线平均，帧平均和帧累积。通过识别开始和结束位置来设置Z堆栈，然后为青春期前卵巢选择两微米的Z步长，为青春期卵巢选择五微米的步长。接下来激活Z补偿功能和激励增益。通过为两者选择激光强度来设置样品底部和顶部的Z补偿。对于无法在单个视场中捕获的较大样本，请使用切片模式。激活图像导航器，并使用矩形标记工具指示捕获整个样品所需的切片数量。设置完成后，从具有多个切片的图像的图像采集开始，使用导航器开始图像采集以捕获所有切片。图像采集后，保存所有图像。如果获取了多个切片，请运行马赛克合并工具将切片合并到单个图像中。要确定卵母细胞的大小，请打开图像并选择切片选项以打开 Zs 堆栈图像。选择线选项和测量面板，并通过从卵母细胞或标记物的一条边缘到最宽点的另一条边缘绘制一条线来确定卵母细胞的X Y直径来测量距离。在堆栈中移动并获得相同类型的多个卵母细胞的直径范围。使用最短长度作为卵母细胞计数的大小选择标准。接下来，在 3D 视图选项中，选择点要素。在场景面板中，激活添加新点功能以打开算法面板。然后取消选择所有算法设置作为大小选择过滤器，并具有先前获得的卵母细胞大小。单击通道前进箭头以移动到源通道。然后选择具有首选标记的通道，并在估计的 X、Y 直径中键入采集的直径。尺寸选择激活模型PSF伸长率和背景减法后，将自动确定。然后，选择单个前进箭头以移动到滤光点面板，并添加质量滤镜以确定阈值。为了确保准确估计卵母细胞数量，放大图像。稍后，单击双箭头以完成自动计数。使用编辑选项卡手动选择遗漏的卵母细胞或取消选择由自动阈值选择的非卵母细胞颗粒。完成后，将数据记录在整体选项卡下的统计信息选项卡中，以便进一步分析。为了估计总卵母细胞数量和受损卵巢，使用MRS打开完整卵巢的图像并选择框架特征。在框架设置下，选择框网格勾选标记并访问标签。在位置XYZ选项卡中，选择200微米以在所有XYZ位置生成具有200微米空间的刻度线。使用200微米刻度线，选择落在每个卵巢体积的50%以内的卵母细胞。单击斑点特征并选择编辑标签，按颜色对落在50%区域内的卵母细胞进行分类。在非灌注和灌注卵巢的代表性灰度多光子图像中，可以看到原始卵泡中的小卵母细胞具有薄层细胞质DDX4染色。此外，还发现了生长中的卵泡中较大的卵母细胞。研究了产前和产后卵巢的多光子图像的3D渲染。在产后第28天，来自对照非辐照女性的卵巢在原始卵泡中含有大量小卵母细胞。相比之下，来自被照射女性的卵巢具有0.5灰度的伽马辐射，在原发卵泡中完全没有小卵母细胞。但更大的卵母细胞仍然存在。为了定量卵母细胞，使用goucian滤光片在MRS软件中处理3D多光子图像，并使用斑点特征鉴定和定量小尺寸和大尺寸的卵母细胞。接下来，计算出各阶段卵母细胞的平均百分比与最早阶段存在的平均数量E相比，卵母细胞数量在E 15.5和E 18.5之间急剧下降，E 15.5和E 18.5胎儿卵母细胞表达第一行或第一P，如多光子图像所示。强度分析显示，每卵母细胞一系或一P在E 18.5时的表达高于E 15.5。损伤小的卵巢可用于分析。使用计算校正确定总卵母细胞数量。代表性模型显示E 15.5卵巢中的G CNA阳性卵母细胞，在完整的卵巢中突出显示了五个10%的区域。同样，产生了一个模拟卵巢，其中10%的增量区域缺失了高达50%的卵巢。将总卵母细胞数和模拟卵巢与原始完整卵巢进行比较。并将差异表示为百分比偏差良好的灌注结果良好的图像质量。因此，在切换到PFA之前，请确保用PBS清除所有组织。通过修剪多余的组织，确保卵巢完全暴露。该协议允许对大量样品进行有效分析，从遗传参考群体获得的定量数据如协作交叉或多样性输出将有助于识别卵母细胞发育的遗传修饰因子和卵母细胞数量。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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用扫描电镜和全贴免疫荧光技术可视化小鼠胚胎中的节点和外型板

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...