Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud (R01 HD093778 til E.B-F og T32 HD007065 til R.B). Vi takker Zachary Boucher for hans hjælp med strålingseksperimentet. Vi takker Mary Ann Händel for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender taknemmeligt bidraget fra Sonia Erattupuzha og Microscopy Core Service på Jackson Laboratory for ekspertbistand med mikroskopiarbejdet beskrevet i denne publikation og Jarek Trapszo fra Scientific Instrument Services på The Jackson Laboratory for at designe det 3D-trykte adapterdias.

Alle anvendte mus var af den genetiske stamme C57BL/6J (se materialetabellen). Denne stamme er blevet fuldt sekventeret og er standard for mange undersøgelser af æggestokkenes struktur og funktion. Mus blev anbragt i henhold til NIH-retningslinjer, og udførte procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser og sammensætninger, der anvendes i denne protokol, er opført i henholdsvis tabel over materialer og tabel 1</s...

Denne artikel præsenterer en detaljeret 3D-immunstainerings- og billeddannelsesprotokol for prænatale og postnatale æggestokke til høj gennemstrømning og komparative undersøgelser til kimcellekvantificering og proteinlokalisering. Vi udviklede denne protokol til at analysere oocyttal i æggestokke (N = 6-12) på seks udviklingstidspunkter i 10-16 forskellige stammer, hvor 2-4 24-brøndsplader typisk behandles ad gangen. Denne metode kan tilpasses andre organer eller cellulære markører. For eksempel kan denne prot...

De fleste pattedyrhunner er født med et begrænset antal meiotisk arresterede oocytter opbevaret i primordiale follikler, der udgør ovariereserven (OR)1,2. OR bestemmer den samlede kvindelige reproduktive levetid og sundhed3. OR falder normalt i størrelse med aldring og kan udtømmes for tidligt ved udsættelse for visse genotoksiske midler (stråling / kemoterapi) og miljøbelastninger (underernæring), hvilket fører til infertilitet 4,5,6. Idiopatisk kvindelig infertilitet kan ofte tilskrives den genetiske og fysiologiske kvalitet af æg, der udvikler sig fra OR og forbliver dårligt forstået 7,8. Fordi kvindelig follikelbegavelse stort set er forudbestemt ved fødslen, er det vigtigt at forstå de reguleringsmekanismer, der er involveret i oprettelsen og vedligeholdelsen af or' or.
I mus starter OR-dannelsen med specifikationen af primordiale kimceller (PGC'er) omkring embryonal dag (E) 7,52. PGC'erne migrerer til kønskanterne, hvor de vil opholde sig med ca. E10,59. Følgende omfattende spredning sker med ufuldstændig cytokinese, der resulterer i dannelse af cyster, der vil blive nedbrudt senere i udvikling10,11. Ved ca. E12,5 bestemmes gonadale køn, og PGC-spredning stopper i æggestokke. Hos kvinder indtaster PGC'er, nu oocytter, meiotisk profase I (MPI) ved ca. E13,5 12,13. Oocytter udvikler sig gennem udvidet MPI og anholdelse på diktatstadiet omkring fødslen. I løbet af den første uge efter fødslen er hver arresteret oocyt omgivet af granulosaceller og danner derved en primordial follikel.
Antallet af primordiale follikler i OR hos en kvinde afhænger af, hvor mange oocytter der overlevede bølgerne af oocyteliminering, der forekommer før og under MPI-anholdelse gennem apoptose, autofagi eller nekrose14,15. Den første bølge opstår under fosterudvikling og er kendt som FOA. FOA er en evolutionært bevaret proces hos hunner (pattedyr og ikke-pattedyr), hvorved anslået 50-80% af oocytterne elimineres afhængigt af hunarten 16,17,18,19. Hos mus forekommer FOA under E15.5 til E18.5 og er blevet tilskrevet reaktivering og ekspression af retrotransposon LINE-1-sekvenser, der forårsager oocytdød20,21. Den anden bølge af oocyteliminering sker gennem et meiotisk kontrolpunkt, der eliminerer oocytter med meiotiske defekter såsom ureparerede DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er)22,23. Den næste bølge af oocyteliminering forekommer under cystenedbrydning, der kulminerer under dannelsen af primordiale follikler, som hver indeholder en enkelt oocyt 10,11,24,25.
Hos mus er den oprindelige follikelreserve stort set etableret ved puberteten, hvorefter den falder, da primordiale follikler aktiveres til vækst under regelmæssige reproduktive cyklusser. OR-størrelsen varierer mellem individuelle kvinder og mellem forskellige genetiske stammer af mus; alligevel er den genetiske regulering af OR-størrelse ikke godt forstået 26,27,28,29. Genetiske undersøgelser af OR-regulering hæmmes af manglen på standardiserede protokoller til at studere bølgerne af oocyteliminering under prænatal og postnatal udvikling. Flere oocytkvantificeringsmetoder er blevet udviklet i mus, hvor den mest almindelige og udbredte er histomorfometrisk evaluering af histologiske sektioner30,31. I denne teknik identificeres oocytter på serielle sektioner med histologiske pletter, såsom hæmatoxylin og eosin (H & E) og periodiske syre-Schiff (PAS) eller fluorescerende markører. Denne teknik er pålidelig, hvis alle forhold forbliver konstante, herunder sektionstykkelse, effektiv genopretning af alle sektioner i hele æggestokken og tælleordningerne i de enkelte laboratorier. Antallet rapporteret af forskellige laboratorier varierer imidlertid ofte betydeligt og er derfor ikke let sammenlignelige.
I betragtning af genetiske forskelle kan brugen af forskellige musestammer desuden også påvirke oocyttællinger. Yderligere beregningsmetoder er udviklet til histomorfometrisk evaluering og omfatter automatiseret detektion af oocytter ved hjælp af fraktionatormetoden, automatisk tælling ved hjælp af beregningsalgoritmer og 3D-rekonstruktion af histologiske billeder for at forhindre flere tællinger af den samme oocyt 31,32,33,34,35,36 . Selv med disse forbedringer tilføjet til histomorfometrisk evaluering er teknikken relativt arbejdskrævende, især til store og højkapacitetsundersøgelser. De indsamlede data er muligvis ikke reproducerbare og sammenlignelige mellem undersøgelser på grund af forskelle i tælleordninger, computeralgoritmer og anvendt software.
For nylig, fremskyndet af udviklingen af nye multifoton- og lysarkmikroskopi og optiske vævsclearingsmetoder, bliver 3D-modellerings- og analyseteknikker til intakte æggestokke den valgte metode til effektivt at kvantificere oocyttal og studere proteinlokalisering og dynamik37,38. Disse 3D-metoder er typisk fordelagtige i forhold til histologiske metoder, da væv og organer bevares bedre og holdes intakte. Desuden giver 3D-analyse og modellering yderligere indsigt i funktion og interaktioner inden for og mellem cellenicher eller understrukturer i organet, der kan gå glip af i 2D-analyse.
3D-analyse af hele organer kræver optimering af fiksering, immunstaining og optiske clearingprotokoller for individuelle organer, såsom æggestokke, uden vævsforvrængning eller skade. Yderligere optimering af prøvemontering til billeddannelse er nødvendig for mikroskopi i høj opløsning og kan afhænge af den tilgængelige billedbehandlingsplatform. Endelig genererer billeddannelse af hele den intakte æggestok en stor mængde data til efterfølgende beregningsanalyser. Derfor er der behov for at udvikle standardiserede 3D-metoder til at tælle oocytter til komparative undersøgelser og på tværs af udviklingsstadier.
Denne protokol bruger standard immunstaining og tidligere rapporterede clearingprotokoller med fokus på en enkel, brugervenlig og høj gennemstrømningsmetode 38,39,40,41. Protokollen er optimeret til at analysere et stort antal prænatale og postnatale æggestokke op til postnatal dag 28 (P28) og varierende størrelser af æggestokke fra forskellige musegenetiske baggrunde. De immunstainerende trin er ens for alle faser; Rydningsprotokollerne adskiller sig imidlertid for pubertetsæggestokker på grund af deres større størrelse, ScaleS4(0) og CUBIC for små og store æggestokke, henholdsvis40,41. Endvidere udføres helkropsperfusion i P28-mus før fiksering for at forhindre autofluorescens fra blodlegemer. Et multifotonmikroskop blev bygget på Leica DIVE/4Tune-platformen som et alternativ til lysarkmikroskopi for at erhverve billeder, og IMARIS 3D-visualiserings- og analysesoftware med forskellige analytiske værktøjer blev valgt til denne protokol. Denne protokol er enkel at følge og mindre praktisk, hvilket sparer tid. Desuden er oocytkvantificering relativt hurtig afhængigt af æggestokkens størrelse og arrangement af oocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Kvindelig fertilitet og reproduktiv levetid afhænger af kvaliteten og mængden af æggestokkens oocytreserve. Anslået 80% af kvindelige kimceller, der kommer ind i meiotisk profase I, elimineres under føtal oocytslidning (FOA) og den første uge af postnatal liv. Tre hovedmekanismer regulerer antallet af oocytter, der overlever under udvikling og etablerer ovariereserven hos kvinder, der går ind i puberteten. I den første bølge af oocyttab elimineres 30-50% af oocytterne under tidlig FOA, et fænomen, der tilskrives højt Langt spredt nukleart element-1 (LINE-1) udtryk. Den anden bølge af oocyttab er eliminering af oocytter med meiotiske defekter ved hjælp af et meiotisk kvalitetskontrolpunkt. Den tredje bølge af oocyttab forekommer perinat under primordial follikeldannelse, når nogle oocytter ikke danner follikler. Det er stadig uklart, hvad der regulerer hver af disse tre bølger af oocyttab, og hvordan de former ovariereserven hos enten mus eller mennesker.
Immunofluorescens og 3D-visualisering har åbnet en ny vej til at afbilde og analysere oocytudvikling i sammenhæng med hele æggestokken snarere end i mindre informative 2D-sektioner. Denne artikel indeholder en omfattende protokol for hel æggestokimmunstainering og optisk clearing, hvilket giver præparater til billeddannelse ved hjælp af multifotonmikroskopi og 3D-modellering ved hjælp af kommercielt tilgængelig software. Det viser, hvordan denne metode kan bruges til at vise dynamikken i oocytnedslidning under ovarieudvikling i C57BL / 6J-mus og kvantificere oocyttab under de tre bølger af oocyteliminering. Denne protokol kan anvendes på prænatale og tidlige postnatale æggestokke til oocytvisualisering og kvantificering samt andre kvantitative tilgange. Det er vigtigt, at protokollen blev strategisk udviklet til at rumme høj gennemstrømning, pålidelig og gentagelig behandling, der kan imødekomme behovene inden for toksikologi, klinisk diagnostik og genomiske assays af ovariefunktion.

Immunstaining og billeddannelse af hele æggestokken muliggør visualisering og kvantificering af oocytter eller proteinekspression i æggestokke på forskellige udviklingsstadier ved hjælp af samme teknik og markører (figur 3). Denne protokol blev udviklet til et stort projekt, hvor analyse af æggestokke i flere faser og fra flere musestammer var påkrævet. Her præsenterer vi data indsamlet for C57BL6/J-stammen, en standardstamme til genetisk analyse. Teknikken, der præsenteres her, e...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Her præsenterer vi en optimeret protokol til billeddannelse af hele æggestokke til kvantitative og kvalitative analyser ved hjælp af helmonteret immunstaining, multifotonmikroskopi og 3D-visualisering og analyse. Denne protokol rummer høj gennemstrømning, pålidelig og repeterbar behandling, der gælder for toksikologi, klinisk diagnostik og genomiske assays af ovariefunktionen.

Hele ovarieimmunfluorescens, clearing og multifotonmikroskopi til kvantitativ 3D-analyse af den udviklende ovariereserve i mus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare et af de centrale spørgsmål på reproduktionsområdet, nemlig hvordan og hvornår genetisk regulerede processer påvirker størrelsen af ovariereserven, som vi ved påvirker kvinder, reproduktiv levetid Denne protokol kan vedtages til storskala undersøgelser ved hjælp af de samme teknikker til intakte æggestokke fra forskellige udviklingsstadier. Det genererer produkter, der kan produceres, ved at tilvejebringe en effektiv kvantificering af kimceller. Denne metode anvendt på genetisk forskelligartede dyr af samme art kan give indsigt i de genetiske faktorer direkte kimcelle- og ovarieudvikling og andre udviklingsorganer.Nathaniel Boechat, en forskningspraktikant fra mit laboratorium For at starte med det store trinsted og sikre den bedøvede pubertale hunmus på ryggen ved forsigtigt at fastgøre alle ben gennem potepuderne i en afslappet position på et bræt. For at åbne musens brysthule skal du omhyggeligt skære ribbenene på begge sider af brystbenet lige under skulderbladet og undgå at punktere lungerne, tag fat i huden eller ribbenklapperne med tangen og fastgør klapperne for at udsætte de indre organer brug dissektionssaks til at klippe hjertets højre atrium og frigive blod fra systemet. Derefter indsættes en perfusionsnål i venstre ventrikel ved at holde hjertet med tang og pumpe 10 ml PBS med et blidt og konstant tryk.Når vævene som levernyrerne og reproduktionskanalen er gået fra lyserød til hvid, erstatter PBS med frisklavet 1 % paraformaldehyd eller PFA og fortsætter perfusionen med ca. 10 ml PFA. Find derefter fedtpuden med æggestokkene under nyrerne og disseker forsigtigt hele reproduktionskanalen, herunder fedtpuden æggestokke og livmoderhorn for at placere den i et hætteglas med 4% PFA. Fastgør æggestokkene ved stuetemperatur i 16 til 24 timer, før du udskifter 4% PFA med 70% ethanol.På dagen for farvningen trimme æggestokkene, inden du fortsætter med immunfarvningen. På dag et af immunfarvningsprotokollen pipetter en milliliter PBS pr. Brønd ind i det ønskede antal brønde i en ren 24 brøndplade. Skær spidsen af en pipettespids på 1000 mikroliter af for at lave en bred åbning, og brug den brede spids til forsigtigt at overføre pubertetsæggestokkene fra hætteglas med 70% ethanol til brøndene, og udskift derefter PBS i brønden med frisk 0,8 ml PBS Den næste dag aspirer PBS fra brøndene for at erstatte den med 0,8 ml per permeationsbuffer pr. Brønd.Efter inkubation af pladerne på rysteren ved stuetemperatur i fire timer udskift permeationsbufferen med blokerende buffer På dag tre forberedes de primære antistoffer ved fortynding i blokeringsbufferen. For at visualisere oocytterne inkuberer de prænatale og præpubertale æggestokke med oocytmarkørerne. På dag otte vaskes prøverne med en frisk vaskebuffer i to timer, og derefter udskiftes vaskebufferen med 0,5 ml af de sekundære antistofblandinger fortyndet i en blokerende buffer.Forsegl pladen med en parafilm for at forhindre fordampning og inkubere prøverne ved stuetemperatur i mørke i tre dage. På dag 11 efter immunfarvningsvasken aspireres vaskebufferen og inkuberes prøverne med 0,8 ml af skalaen kubisk en opløsning ved 37 grader Celsius i tre dage i mørket. Ændring af skalaen kubisk en løsning dagligt.På dag 15 vaskes prøverne tre gange i 10 minutter og 0,8 ml PBS ved stuetemperatur med blid omrystning. Udskift derefter PBS med 0,8 ml af den frisklavede afgassede 20% saccharose med PBS efterfulgt af blid omrystning ved stuetemperatur. Efter en time udskiftes 20% saccharoseopløsningen for at behandle prøverne med 0,8 ml af skalaen kubisk to opløsning i fire til fem dage, som forklaret tidligere.For at forberede en prøveopsætning skal du bruge en 200 mikroliter pipettespids med spidsafskæringen til at overføre pubertetsæggestokkene med 15 til 20 mikroliter skala kubisk to opløsning ind i midten af klæbemiddelbrønden. Når æggestokkene er overført til den enkelte brønd med en dråbe clearingopløsning, anbring forsigtigt et dækglas på klæbebrønden og tryk for at skabe en tætning, der sandwicher prøverne og rydder opløsningen mellem to dæksedler. Til billeddannelsessted glider dækslet sandwich i et 3D-trykt mikroskopadapter dias.Konfigurer parametrene for billedoptagelse i henhold til mikroskopikernerne eller producentens specifikationer. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge den tovejs billedoptagelse til at reducere scanningstiden og forbedre effektiviteten. Juster linjegennemsnittet, rammegennemsnittet og rammeakkumuleringen i softwaren.Konfigurer Z-stakken ved at identificere begyndelses- og slutpositionen, og vælg derefter en Z-trinstørrelse på to mikrometer til præpubertale æggestokke og fem mikrometer til pubertetsæggestokke. Aktivér derefter Z-kompensationsfunktionen og excitationsgevinsten. Indstil Z-kompensationen for bunden og toppen af prøven ved at vælge en laserintensitet for begge.Brug flisetilstanden til større eksempler, der ikke kan hentes i et enkelt synsfelt. Aktivér billednavigatoren, og angiv antallet af felter, der er nødvendige for at fange hele prøven med det rektangulære markeringsværktøj. Når indstillingen er udført, skal du starte med billedoptagelsen for billederne med flere fliser, begynde billedindsamling med navigatoren for at fange alle fliser.Efter billedoptagelsen skal du gemme alle billederne. Og hvis der blev erhvervet flere fliser, skal du køre mosaikfusionsværktøjet for at flette fliserne til et enkelt billede. For at bestemme størrelsen på oocytterne skal du åbne billedet og vælge udsnitsindstillingen for at åbne Zs-stakbilledet.Vælg linjeindstillingen og målepanelet, og mål afstanden ved at tegne en linje fra den ene kant af en oocytter eller markør til den anden kant på det bredeste punkt for at bestemme oocyttens X Y-diameter. Flyt gennem stakken og få området af diametre til flere oocytter af samme type. Brug den korteste længde som størrelsesudvælgelseskriterium for oocytter tæller.Vælg derefter spotsfunktionen i indstillingen 3D-visning. I scenepanelet skal du aktivere funktionen Tilføj nye pletter for at åbne algoritmepanelet. Fravælg derefter alle algoritmeindstillingerne som størrelsesvalgsfilter med den oocytstørrelse, der er opnået tidligere.Klik på pilen kanal fremad for at flytte til kildekanalen. Vælg derefter kanalen med den foretrukne markør, og skriv den erhvervede diameter i den estimerede X, Y-diameter. Efter størrelsesvalget aktiveres modellen PSF-forlængelse og baggrundssubtraktion, som automatisk bestemmes.Vælg derefter den enkelte pil fremad for at flytte til panelet filterpunkter, og tilføj kvalitetsfilteret for at bestemme en tærskel. For at sikre den nøjagtige estimering af oocytters tal forstørres billedet. Senere skal du klikke på dobbeltpilen for at afslutte automatiserede optællinger.Brug redigeringsfanen til manuelt at vælge ubesvarede oocytter eller fravælge ikke-oocytpartikler valgt af den automatiske tærskel. Når du er færdig, skal du registrere dataene under fanen Statistik under fanen Samlet for yderligere analyse. For at estimere det samlede oocyttal og de beskadigede æggestokke skal du åbne billeder af de intakte æggestokke med MRS og vælge rammefunktionen.Under rammeindstillingerne skal du markere afkrydsningsfeltet gittermærker og adgangsetiketter. På fanen POSITION XYZ skal du vælge 200 mikrom for at generere flueben med 200 mikrometer mellemrum i alle XYZ-positioner. Brug 200 mikrometer krydsmærkerne til at vælge oocytter, der falder inden for 50% af volumenet af hver æggestok.Klik på spots-funktionen, og vælg redigeringsetiketterne for at klassificere de oocytter, der falder inden for 50% -området efter farve. I den repræsentative gråtone kunne multifotonbilleder af de ikke-perfuserede og perfusionerede æggestokke, de små oocytter i primordiale follikler med det tynde lag cytoplasmatisk DDX4-farvning ses. Derudover blev de større oocytter i de voksende follikler spottet.3D-gengivelserne fra multifotonbillederne af prænatal og postnatal æggestokke blev undersøgt. På postnatal dag 28 indeholdt æggestokken fra kontrol ikke-bestrålet kvinde en stor population af små oocytter i de oprindelige follikler. I modsætning hertil var æggestokkene fra den bestrålede kvinde med 0,5 grå af gammastrålingen fuldstændig blottet for små oocytter i de primære follikler.Men større oocytter var stadig til stede. Til kvantificering af oocytterne blev 3D-multifotonbillederne behandlet i MRS-softwaren ved hjælp af det goucianske filter, og oocytterne i små og store størrelser blev identificeret og kvantificeret ved hjælp af spotfunktionen. Dernæst blev den gennemsnitlige procentdel af oocytterne beregnet på hvert trin sammenlignet med det gennemsnitlige antal, der var til stede i det tidligste stadium E 15,5 oocytter tal faldt kraftigt mellem E 15,5 og E 18,5 E 15,5 og E 18,5 føtale oocytter udtrykt linje en orf en P som det ses i multifotonbillederne.Intensitetsanalysen viste højere ekspression af linje en orf en P pr. oocytter ved E 18,5 end E 15,5. Æggestokkene med små skader kan bruges til analyse. Samlede oocytter tal bestemmes ved hjælp af beregningskorrektion.Den repræsentative model viser G CNA-positive oocytter i E 15,5-æggestokken med fem 10% regioner fremhævet i en intakt æggestok. Tilsvarende blev der genereret en simuleret æggestok med 10% trinvise regioner, der manglede op til 50% af æggestokken. De samlede oocytter og de simulerede æggestokke blev sammenlignet med de oprindelige intakte æggestokke.Og forskellen blev præsenteret som procentafvigelsen God perfusion resulterer i god billedkvalitet. Så sørg for, at alt væv er ryddet med PBS, inden du skifter til PFA. Sørg for, at æggestokkene er helt eksponeret ved at trimme det ekstra væv væk.Protokollen muliggør effektiv analyse af et stort antal prøver, kvantitative data opnået fra genetiske referencepopulationer såsom kollaborativ kryds eller mangfoldighedsoutput vil hjælpe med at identificere genetiske modifikatorer af oocytters udvikling og oocytter tal.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-kultur Mouse æggestokke og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescens og follikel kvantificering af kulturperler mus æggestokke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Æggestokkene væv kultur at visualisere fænomener i mus æggestok

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...