Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies (R01 HD093778 aan E.B-F en T32 HD007065 aan R.B). We bedanken Zachary Boucher voor zijn hulp bij het stralingsexperiment. We danken Mary Ann Händel voor het kritisch lezen van het manuscript. We zijn dankbaar voor de bijdrage van Sonia Erattupuzha en de Microscopy Core Service van The Jackson Laboratory voor deskundige hulp bij het microscopiewerk dat in deze publicatie wordt beschreven en Jarek Trapszo van de Scientific Instrument Services van The Jackson Laboratory voor het ontwerpen van de 3D-geprinte adapterdia.

Alle gebruikte muizen waren van de genetische stam C57BL/6J (zie de Tabel met Materialen). Deze stam is volledig gesequenced en is standaard voor veel studies naar de structuur en functie van de eierstokken. Muizen werden gehuisvest volgens de NIH-richtlijnen en de uitgevoerde procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van The Jackson Laboratory. De in dit protocol gebruikte reagentia en samenstellingen zijn respectievelijk vermeld in de tabel met materiale...

Dit artikel presenteert een gedetailleerd 3D-immunostaining- en beeldvormingsprotocol voor prenatale en postnatale eierstokken voor high-throughput en vergelijkende studies voor kiemcelkwantificering en eiwitlokalisatie. We hebben dit protocol ontwikkeld om het aantal eicellen in de eierstokken (N = 6-12) op zes ontwikkelingstijdpunten in 10-16 verschillende stammen te analyseren, waar 2-4 24-well platen meestal in één keer worden verwerkt. Deze methode kan worden aangepast voor andere organen of cellulaire markers. Di...

De meeste vrouwtjes van zoogdieren worden geboren met een eindig aantal meiotisch gearresteerde eicellen die zijn opgeslagen in primordiale follikels, die de ovariële reserve (OR)1,2 vormen. De OK bepaalt de totale vrouwelijke reproductieve levensduur en gezondheid3. De OK neemt normaal gesproken in omvang af met het ouder worden en kan voortijdig worden uitgeput bij blootstelling aan bepaalde genotoxische middelen (bestraling / chemotherapie) en omgevingsstress (ondervoeding), wat leidt tot onvruchtbaarheid 4,5,6. Idiopathische vrouwelijke onvruchtbaarheid kan vaak worden toegeschreven aan de genetische en fysiologische kwaliteit van eieren die zich ontwikkelen uit de OK en blijft slecht begrepen 7,8. Omdat vrouwelijke follikelbegiftiging grotendeels vooraf wordt bepaald door de geboorte, is het essentieel om de regulerende mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij de oprichting en het onderhoud van de OK.
Bij muizen begint OR-vorming met de specificatie van primordiale geslachtscellen (PPC's) rond Embryonale dag (E) 7,52. De PPC's migreren naar de genitale richels, waar ze zich ongeveer E10,59 zullen bevinden. De volgende uitgebreide proliferatie treedt op met onvolledige cytokinese, wat resulteert in de vorming van cysten die later in de ontwikkeling zullen worden afgebroken10,11. Bij ongeveer E12,5 wordt gonadale seks bepaald en stopt de PGC-proliferatie in de eierstokken. Bij vrouwen komen PPC's, nu eicellen, in meiotische profase I (MPI) bij ongeveer E13,512,13. Eicellen vorderen door uitgebreide MPI en arrestatie in het dictyaatstadium rond het tijdstip van geboorte. Tijdens de eerste week na de geboorte wordt elke gearresteerde eicel omgeven door granulosacellen, waardoor een primordiale follikel wordt gevormd.
Het aantal primordiale follikels in de OK van een vrouw hangt af van hoeveel eicellen de golven van oöcytenverwijdering hebben overleefd die vóór en tijdens MPI-arrestatie optreden door apoptose, autofagie of necrose 14,15. De eerste golf treedt op tijdens de foetale ontwikkeling en staat bekend als FOA. FOA is een evolutionair geconserveerd proces bij vrouwtjes (zoogdieren en niet-zoogdieren), waarbij naar schatting 50-80% van de eicellen wordt geëlimineerd, afhankelijk van de vrouwelijke soort 16,17,18,19. Bij muizen treedt FOA op tijdens E15.5 tot E18.5 en is toegeschreven aan de reactivering en expressie van retrotransposon LINE-1-sequenties die oöcytsterfte veroorzaken20,21. De tweede golf van oöcytenexplosie vindt plaats via een meiotisch controlepunt dat eicellen elimineert met meiotische defecten zoals ongerepareerde DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's)22,23. De volgende golf van oöcytuitschakeling vindt plaats tijdens cysteafbraak, culminerend in de vorming van primordiale follikels, die elk een enkele eicel 10,11,24,25 bevatten.
Bij muizen wordt de primordiale follikelreserve grotendeels vastgesteld door de puberteit, waarna deze afneemt naarmate primordiale follikels worden geactiveerd voor groei tijdens regelmatige voortplantingscycli. De OR-grootte varieert tussen individuele vrouwen en tussen verschillende genetische muizenstammen; toch is de genetische regulatie van OR-grootte niet goed begrepen 26,27,28,29. Genetische studies van OR-regulatie worden belemmerd door het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen om de golven van oöcyten eliminatie tijdens prenatale en postnatale ontwikkeling te bestuderen. Bij muizen zijn verschillende methoden voor het kwantificeren van eicellen ontwikkeld, met als meest voorkomende en meest gebruikte histomorfometrische evaluatie van histologische secties30,31. In deze techniek worden eicellen geïdentificeerd op seriële secties met histologische vlekken, zoals hematoxyline en eosine (H & E) en periodieke zuur-Schiff (PAS) of fluorescerende markers. Deze techniek is betrouwbaar als alle omstandigheden constant blijven, inclusief sectiedikte, efficiënt herstel van alle secties in de eierstok en de telschema's van individuele laboratoria. De aantallen die door verschillende laboratoria worden gerapporteerd, verschillen echter vaak aanzienlijk en zijn dus niet gemakkelijk vergelijkbaar.
Bovendien kan, gezien genetische verschillen, het gebruik van verschillende muizenstammen ook het aantal eicellen beïnvloeden. Aanvullende computationele benaderingen zijn ontwikkeld voor histomorfometrische evaluatie en omvatten de geautomatiseerde detectie van eicellen met behulp van de fractionatorbenadering, automatisch tellen met behulp van computationele algoritmen en 3D-reconstructie van histologische beelden om meerdere tellingen van dezelfde eicel te voorkomen 31,32,33,34,35,36 . Zelfs met deze verbeteringen toegevoegd aan histomorfometrische evaluatie, is de techniek relatief arbeidsintensief, met name voor grootschalige en high-throughput studies. De verzamelde gegevens zijn mogelijk niet reproduceerbaar en vergelijkbaar tussen studies vanwege verschillen in telschema's, computeralgoritmen en gebruikte software.
Onlangs, versneld door de ontwikkeling van nieuwe medium-resolutie multifoton en lichtplaatmicroscopie en optische weefselverwijderingsmethoden, worden 3D-modellerings- en analysetechnieken voor intacte eierstokken de voorkeursmethode om het aantal eicellen efficiënt te kwantificeren en eiwitlokalisatie en -dynamiek te bestuderen37,38. Deze 3D-methoden zijn meestal voordelig in vergelijking met histologische methoden, omdat weefsels en organen beter worden bewaard en intact worden gehouden. Bovendien bieden 3D-analyse en modellering aanvullende inzichten in functie en interacties binnen en tussen celniches of substructuren binnen het orgaan die kunnen worden gemist in 2D-analyse.
3D-analyse van hele organen vereist optimalisatie van fixatie-, immunostaining- en optische clearingprotocollen voor individuele organen, zoals eierstokken, zonder weefselvervorming of schade. Aanvullende optimalisatie van monstermontage voor beeldvorming is vereist voor microscopie met hoge resolutie en kan afhankelijk zijn van het beschikbare beeldvormingsplatform. Ten slotte genereert beeldvorming van de hele intacte eierstok een grote hoeveelheid gegevens voor daaropvolgende computationele analyses. Daarom is er behoefte aan gestandaardiseerde 3D-methoden voor het tellen van eicellen voor vergelijkende studies en in verschillende ontwikkelingsstadia.
Dit protocol maakt gebruik van standaard immunostaining en eerder gerapporteerde clearingprotocollen, gericht op een eenvoudige, gebruiksvriendelijke en high-throughput aanpak 38,39,40,41. Het protocol is geoptimaliseerd om grote aantallen prenatale en postnatale eierstokken te analyseren tot postnatale dag 28 (P28) en verschillende groottes van eierstokken met verschillende genetische achtergronden van muizen. De immunostaining stappen zijn vergelijkbaar voor alle stadia; de clearingprotocollen verschillen echter voor puberale eierstokken vanwege hun grotere omvang, ScaleS4(0) en CUBIC voor kleine en grote eierstokken, respectievelijk40,41. Verder wordt perfusie van het hele lichaam uitgevoerd in P28-muizen vóór fixatie om autofluorescentie uit bloedcellen te voorkomen. Een multifotonenmicroscoop werd gebouwd op het Leica DIVE/4Tune-platform als alternatief voor lichtplaatmicroscopie om beelden te verkrijgen, en IMARIS 3D Visualisatie- en Analysesoftware met verschillende analytische hulpmiddelen werd gekozen voor dit protocol. Dit protocol is eenvoudig te volgen en minder hands-on, dus tijdbesparend. Bovendien is de kwantificering van eicellen relatief snel, afhankelijk van de grootte van de eierstok en de rangschikking van de eicellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Vrouwelijke vruchtbaarheid en reproductieve levensduur zijn afhankelijk van de kwaliteit en kwantiteit van de oöcytenreserve voor de eierstokken. Naar schatting 80% van de vrouwelijke geslachtscellen die meiotische profase I binnenkomen, worden geëlimineerd tijdens foetale oöcyattritie (FOA) en de eerste week van het postnatale leven. Drie belangrijke mechanismen reguleren het aantal eicellen dat tijdens de ontwikkeling overleeft en vestigen de ovariële reserve bij vrouwen die de puberteit ingaan. In de eerste golf van eicelverlies wordt 30-50% van de eicellen geëlimineerd tijdens vroege FOA, een fenomeen dat wordt toegeschreven aan hoge lange interspersed nucleaire element-1 (LINE-1) expressie. De tweede golf van oöcytenverlies is de eliminatie van eicellen met meiotische defecten door een meiotisch kwaliteitscontrolepunt. De derde golf van oöcytverlies treedt perinataal op tijdens primordiale follikelvorming wanneer sommige eicellen er niet in slagen follikels te vormen. Het blijft onduidelijk wat elk van deze drie golven van eicelverlies reguleert en hoe ze de ovariële reserve vormen bij muizen of mensen.
Immunofluorescentie en 3D-visualisatie hebben een nieuwe weg geopend om de ontwikkeling van eicellen in beeld te brengen en te analyseren in de context van de hele eierstok in plaats van in minder informatieve 2D-secties. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor immunostaining van de hele eierstokken en optische clearing, wat voorbereidingen oplevert voor beeldvorming met behulp van multifotonenmicroscopie en 3D-modellering met behulp van commercieel beschikbare software. Het laat zien hoe deze methode kan worden gebruikt om de dynamiek van oöcytenafbraak tijdens de oövarieuze ontwikkeling bij C57BL / 6J-muizen aan te tonen en het verlies van eicellen tijdens de drie golven van oöcytuitschakeling te kwantificeren. Dit protocol kan worden toegepast op prenatale en vroege postnatale eierstokken voor oöcytvisualisatie en kwantificering, evenals andere kwantitatieve benaderingen. Belangrijk is dat het protocol strategisch is ontwikkeld om plaats te bieden aan een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die kan voldoen aan de behoeften in toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Immunostaining en beeldvorming van de hele eierstok maakt de visualisatie en kwantificering van eicellen of eiwitexpressie in eierstokken in verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk met behulp van dezelfde techniek en markers (figuur 3). Dit protocol is ontwikkeld voor een grootschalig project waarbij analyse van eierstokken in meerdere stadia en van meerdere muizenstammen nodig was. Hier presenteren we gegevens die zijn verzameld voor de C57BL6 / J-stam, een standaardstam voor genetische ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het in beeld brengen van hele eierstokken voor kwantitatieve en kwalitatieve analyses met behulp van whole-mount immunostaining, multifotonenmicroscopie en 3D-visualisatie en -analyse. Dit protocol biedt een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die van toepassing is op toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een van de belangrijkste vragen op het gebied van voortplanting, namelijk hoe en wanneer genetisch gereguleerde processen de grootte van de ovariële reserve beïnvloeden waarvan we weten dat ze van invloed zijn op vrouwen, reproductieve levensduur Dit protocol kan worden aangenomen voor grootschalige studies met dezelfde technieken voor intacte eierstokken uit verschillende ontwikkelingsstadia. Het genereert produceerbare gegevens door een efficiënte kwantificering van geslachtscellen te bieden. Deze methode toegepast op genetisch diverse dieren van dezelfde soort kan inzicht geven in de genetische factoren direct kiemcel- en eierstokontwikkeling en andere ontwikkelingsorganen.De procedure wordt gedemonstreerd door Nathaniel Boechat, een onderzoeksstagiair uit mijn laboratorium Om te beginnen met de overdaadstapplaats en de verdoofde puberale vrouwelijke muis op zijn rug vast te zetten door alle benen zachtjes door de voetzolen in een ontspannen positie op een plank te pinnen. Om de thoracale holte van de muis te openen, snijdt u voorzichtig de ribben aan beide zijden van het borstbeen net onder de scapula, vermijdt u het doorboren van de longen, grijpt u de huid of ribflappen met de tang en pint u de flappen vast om de inwendige organen bloot te leggen, gebruikt u een dissectieschaar om het rechteratrium van het hart te knippen en bloed uit het systeem vrij te maken. Steek vervolgens door het hart met een tang vast te houden een perfusienaald in de linker ventrikel en pomp 10 milliliter PBS met een zachte en constante druk.Wanneer de weefsels zoals de levernieren en het voortplantingskanaal van roze naar wit zijn gedraaid, vervangen ze de PBS door vers gemaakte 1% paraformaldehyde of PFA en gaan ze door met de perfusie met ongeveer 10 milliliter PFA. Lokaliseer vervolgens het vetkussen met de eierstokken onder de nier en ontleed voorzichtig het hele voortplantingskanaal inclusief de vetkussen eierstokken en baarmoederhoorns om het in een injectieflacon met 4% PFA te plaatsen. Fixeer de eierstokken gedurende 16 tot 24 uur op kamertemperatuur voordat u de 4% PFA vervangt door 70% ethanol.Op de dag van de kleuring trim de eierstokken voordat u verder gaat met de immunokleuring. Op dag één van het immunokleuringsprotocol pipetteer één milliliter PBS per put in het gewenste aantal putten in een schone 24 putplaat. Snijd de punt van een pipetpunt van 1000 microliter af om een brede opening te maken en gebruik de brede punt om de puberale eierstokken voorzichtig van injectieflacons met 70% ethanol in de putten over te brengen en vervang PBS in de put door verse 0,8 milliliter PBS De volgende dag zuig PBS uit de putten om het te vervangen door 0,8 milliliter van de permeatiebuffer per put.Na het incuberen van de platen op de shaker bij kamertemperatuur gedurende vier uur vervangt u de permeatiebuffer door de blokkerende buffer Op dag drie bereidt u de primaire antilichamen voor door verdunning in de blokkerende buffer. Om de eicellen te visualiseren, incuberen de prenatale en prepuberale eierstokken met de eicelmarkers. Was de monsters op dag acht gedurende twee uur met een verse wasbuffer en vervang vervolgens de wasbuffer door 0,5 milliliter van de secundaire antilichaammengsels verdund in een blokkerende buffer.Sluit de plaat af met een parafilm om verdamping te voorkomen en incubeer de monsters bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie dagen. Op dag 11 na de immunokleuringswas, zuig de wasbuffer op en incubeer de monsters met 0,8 milliliter van de schaalkubieke één oplossing bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen in het donker. Dagelijks de weegschaal één oplossing veranderen.Was de monsters op dag 15 driemaal gedurende 10 minuten en 0,8 milliliter PBS bij kamertemperatuur met zacht schudden. Vervang vervolgens de PBS door 0,8 milliliter van de vers bereide ontgaste 20% sucrose met PBS gevolgd door zacht schudden bij kamertemperatuur. Vervang na een uur de 20% sucrose-oplossing om de monsters te behandelen door 0,8 milliliter van de schaal kubieke twee oplossing gedurende vier tot vijf dagen, zoals eerder uitgelegd.Om een monsteropstelling voor te bereiden, gebruikt u een pipetpunt van 200 microliter met de puntafsnijding om de puberale eierstokken met 15 tot 20 microliter schaalkubieke twee oplossing in het midden van de lijmput over te brengen. Zodra de eierstokken in de individuele put zijn overgebracht met een druppel opruimoplossing, plaatst u voorzichtig een dekglas op de kleefput en drukt u om een afdichting te maken die de monsters en de oplossing tussen twee afdekslips sandwicht. Voor beeldvorming plaats, de cover slip sandwich in een 3D-geprinte microscoop adapter dia.Stel de parameters voor beeldacquisitie in op basis van de microscopiekernen of de specificaties van de fabrikant. Gebruik indien beschikbaar de bidirectionele beeldacquisitie om de scantijd te verkorten en de efficiëntie te verbeteren. Pas het lijngemiddelde, het framegemiddelde en de frameaccumulatie in de software aan.Stel de Z-stack in door de begin- en eindpositie te identificeren en selecteer vervolgens een Z-stapgrootte van twee micrometer voor prepuberale eierstokken en vijf micrometer voor puberale eierstokken. Activeer vervolgens de Z-compensatiefunctie en de excitatieversterking. Stel de Z-compensatie voor de onderkant en bovenkant van het monster in door een laserintensiteit voor beide te selecteren.Gebruik de tegelmodus voor grotere monsters die niet in één gezichtsveld kunnen worden vastgelegd. Activeer de afbeeldingsnavigator en geef het aantal tegels aan dat nodig is om het volledige monster vast te leggen met het rechthoekige markeergereedschap. Zodra de instelling is voltooid, begint u met de beeldacquisitie voor de afbeeldingen met meerdere tegels, begint u met de afbeeldingsacquisitie met de navigator om alle tegels vast te leggen.Sla na de beeldacquisitie alle afbeeldingen op. En als er meerdere tegels zijn verkregen, voert u het gereedschap mozaïek samenvoegen uit om de tegels samen te voegen tot één afbeelding. Als u de grootte van de eicellen wilt bepalen, opent u de afbeelding en selecteert u de segmentoptie om de afbeelding van de Zs-stapel te openen.Selecteer de lijnoptie en het meetpaneel en meet de afstand door een lijn te tekenen van de ene rand van een eicel of marker naar de andere rand op het breedste punt om de X Y-diameter van de eicel te bepalen. Beweeg door de stapel en verkrijg het bereik van diameters voor meerdere eicellen van hetzelfde type. Gebruik de kortste lengte als het grootteselectiecriterium voor eicellen telt.Selecteer vervolgens in de optie 3D-weergave de spotfunctie. Activeer in het scènepaneel de functie Nieuwe spots toevoegen om het algoritmepaneel te openen. Schakel vervolgens alle algoritme-instellingen uit als het grootteselectiefilter met de eerder verkregen eicellengrootte.Klik op de kanaal pijl vooruit om naar het bronkanaal te gaan. Selecteer vervolgens het kanaal met de gewenste marker en typ de verkregen diameter in de geschatte X, Y-diameter. Na de grootteselectie activeert u de psf-rek en achtergrondaftrek van het model die automatisch worden bepaald.Kies vervolgens de enkele pijl-vooruit om naar het deelvenster filterpunten te gaan en voeg het kwaliteitsfilter toe om een drempelwaarde te bepalen. Om de nauwkeurige schatting van het aantal eicellen te garanderen, vergroot u het beeld. Klik later op de dubbele pijl om geautomatiseerde tellingen te voltooien.Gebruik het tabblad Bewerken om handmatig gemiste eicellen te selecteren of om niet-eiceldeeltjes te deselecteren die zijn geselecteerd door de automatische drempelwaarde. Als u klaar bent, registreert u de gegevens op het tabblad Statistieken onder het algemene tabblad voor verdere analyse. Om het totale aantal eicellen en de beschadigde eierstokken te schatten, opent u afbeeldingen van de intacte eierstokken met MRS en selecteert u de framefunctie.Schakel onder de frame-instellingen de selectievakjes voor het raster en de toegangslabels in. Selecteer in de positie XYZ tab 200 microme om vinkjes te genereren met 200 micrometer ruimtes in alle XYZ posities. Selecteer met behulp van de vinkjes van 200 micrometer eicellen die binnen 50% van het volume van elke eierstok vallen.Klik op de vlekkenfunctie en selecteer de bewerkingslabels om de eicellen die binnen het 50%-gebied vallen op kleur te classificeren. In de representatieve grijswaarden, multifotonenbeelden van de niet-geperfundeerde en geperfundeerde eierstokken, waren de kleine eicellen in primordiale follikels met de dunne laag cytoplasmatische DDX4-kleuring te zien. Bovendien werden de grotere eicellen in de groeiende follikels gespot.De 3D-weergaven van de multifotonbeelden van de prenatale en de postnatale eierstokken werden bestudeerd. Op de postnatale dag 28 bevatte de eierstok van het niet-bestraalde vrouwelijke een grote populatie van kleine eicellen in de primordiale follikels. Daarentegen waren de eierstokken van het bestraalde vrouwtje met 0,5 grijs van de gammastraling volledig verstoken van kleine eicellen in de primaire follikels.Maar grotere eicellen waren nog steeds aanwezig. Voor de kwantificering van de eicellen werden de 3D multifotonbeelden verwerkt in de MRS-software met behulp van het goucianfilter en de eicellen van kleine en grote afmetingen werden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van de spotfunctie. Vervolgens werd het gemiddelde percentage van de eicellen in elk stadium berekend in vergelijking met het gemiddelde aantal aanwezig in het vroegste stadium E 15,5 eicellen aantallen daalden sterk tussen E 15,5 en E 18,5 de E 15,5 en E 18,5 foetale oöcyten uitgedrukt lijn één of één P zoals te zien in de multifotonenafbeeldingen.De intensiteitsanalyse toonde hogere expressies van lijn één of één P per eicel bij E 18,5 dan E 15,5. De eierstokken met kleine schade kunnen worden gebruikt voor analyse. Het totale aantal eicellen wordt bepaald met behulp van computationele correctie.Het representatieve model toont G CNA-positieve eicellen in de E 15,5-eierstok met vijf 10%-gebieden gemarkeerd in een intacte eierstok. Op dezelfde manier werd een gesimuleerde eierstok gegenereerd met 10% incrementele gebieden die tot 50% van de eierstok misten. Het totale aantal eicellen en de gesimuleerde eierstokken werden vergeleken met de oorspronkelijke intacte eierstokken.En het verschil werd gepresenteerd als de procentuele afwijking Goede perfusie resulteert in een goede beeldkwaliteit. Zorg er dus voor dat alle weefsels worden gewist met PBS voordat u overschakelt naar PFA. Zorg ervoor dat de eierstokken volledig worden blootgesteld door het extra weefsel weg te knippen.Het protocol maakt een efficiënte analyse van een groot aantal monsters mogelijk, kwantitatieve gegevens verkregen uit genetische referentiepopulaties zoals gezamenlijke kruis- of diversiteitsoutput zullen helpen bij het identificeren van genetische modifiers van de ontwikkeling van eicellen en het aantal eicellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...