Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (R01 HD093778 à E.B-F et T32 HD007065 à R.B). Nous remercions Zachary Boucher pour son aide dans l’expérience de radiation. Nous remercions Mary Ann Haendel pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Sonia Erattupuzha et le service de base de microscopie du Jackson Laboratory pour leur aide spécialisée dans les travaux de microscopie décrits dans cette publication et Jarek Trapszo des Scientific Instrument Services du Jackson Laboratory pour la conception de la diapositive de l’adaptateur imprimé en 3D.

Toutes les souris utilisées étaient de la souche génétique C57BL/6J (voir la table des matériaux). Cette souche a été entièrement séquencée et est la norme pour de nombreuses études sur la structure et la fonction ovariennes. Les souris ont été hébergées conformément aux directives des NIH et les procédures effectuées ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Jackson Laboratory. Les réactifs et les compositions utilisés dans ce prot...

Cet article présente un protocole détaillé d’immunocoloration et d’imagerie 3D pour les ovaires prénataux et postnatals pour les études comparatives et à haut débit pour la quantification des cellules germinales et la localisation des protéines. Nous avons développé ce protocole pour analyser le nombre d’ovocytes dans les ovaires (N = 6-12) à six points temporels de développement dans 10-16 souches différentes, où 2-4 plaques de 24 puits sont généralement traitées en même temps. Cette méthode peu...

La plupart des femelles mammifères naissent avec un nombre fini d’ovocytes arrêtés méiotiquement stockés dans des follicules primordiaux, constituant la réserve ovarienne (RC)1,2. La RO détermine la durée de vie reproductive globale et la santé des femmes3. La salle d’opération diminue normalement en taille avec le vieillissement et peut être épuisée prématurément lors de l’exposition à certains agents génotoxiques (radiothérapie / chimiothérapie) et à des stress environnementaux (malnutrition), conduisant à l’infertilité 4,5,6. L’infertilité féminine idiopathique peut souvent être attribuée à la qualité génétique et physiologique des ovules qui se développent à partir de la salle d’opération et reste mal comprise 7,8. Étant donné que la dotation en follicules féminins est largement prédéterminée par la naissance, il est essentiel de comprendre les mécanismes de régulation impliqués dans l’établissement et l’entretien de la salle d’opération.
Chez la souris, la formation de RO commence par la spécification des cellules germinales primordiales (PGC) autour du jour embryonnaire (E) 7,52. Les PGC migrent vers les crêtes génitales, où ils résideront vers E10,59. La prolifération étendue suivante se produit avec une cytocinèse incomplète entraînant la formation de kystes qui seront décomposés plus tard dans le développement10,11. À environ E12,5, le sexe gonadique est déterminé et la prolifération de la PGC s’arrête dans les ovaires. Chez les femelles, les PGC, maintenant des ovocytes, entrent dans la prophase méiotique I (MPI) à environ E13,512,13. Les ovocytes progressent grâce à une MPI prolongée et à un arrêt au stade du dictyat au moment de la naissance. Au cours de la première semaine après la naissance, chaque ovocyte arrêté est entouré de cellules de granulosa, formant ainsi un follicule primordial.
Le nombre de follicules primordiaux dans la salle d’opération d’une femme dépend du nombre d’ovocytes qui ont survécu aux vagues d’élimination des ovocytes qui se produisent avant et pendant l’arrêt de la MPI par apoptose, autophagie ou nécrose14,15. La première vague se produit pendant le développement du fœtus et est connue sous le nom de FOA. Le FOA est un processus conservé de manière évolutive chez les femelles (mammifères et non mammifères), par lequel environ 50 à 80% des ovocytes sont éliminés en fonction des espèces femelles 16,17,18,19. Chez la souris, le FOA se produit au cours de E15,5 à E18.5 et a été attribué à la réactivation et à l’expression de séquences de rétrotransposon LINE-1 provoquant la mort des ovocytes20,21. La deuxième vague d’élimination des ovocytes se produit par un point de contrôle méiotique qui élimine les ovocytes présentant des défauts méiotiques tels que les cassures double brin d’ADN non réparées (DSB)22,23. La prochaine vague d’élimination des ovocytes se produit lors de la dégradation des kystes, culminant lors de la formation de follicules primordiaux, dont chacun contient un seul ovocyte 10,11,24,25.
Chez la souris, la réserve de follicules primordiaux est largement établie par la puberté, après quoi elle diminue à mesure que les follicules primordiaux sont activés pour la croissance au cours des cycles de reproduction réguliers. La taille de la salle d’opération varie d’une femme à l’autre et de différentes souches génétiques de souris; pourtant, la régulation génétique de la taille des salles d’opération n’est pas bien comprise 26,27,28,29. Les études génétiques de la régulation de la RO sont entravées par l’absence de protocoles standardisés pour étudier les vagues d’élimination des ovocytes au cours du développement prénatal et postnatal. Plusieurs méthodes de quantification des ovocytes ont été développées chez la souris, la plus courante et la plus largement utilisée étant l’évaluation histomorphométrique des sectionshistologiques 30,31. Dans cette technique, les ovocytes sont identifiés sur des coupes en série avec des taches histologiques, telles que l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et l’acide-Schiff périodique (PAS) ou des marqueurs fluorescents. Cette technique est fiable si toutes les conditions restent constantes, y compris l’épaisseur de la section, la récupération efficace de toutes les sections dans l’ovaire et les schémas de comptage des laboratoires individuels. Cependant, les chiffres rapportés par les différents laboratoires diffèrent souvent de manière significative et ne sont donc pas facilement comparables.
De plus, compte tenu des différences génétiques, l’utilisation de différentes souches de souris peut également influencer le nombre d’ovocytes. D’autres approches computationnelles ont été développées pour l’évaluation histomorphométrique et comprennent la détection automatisée des ovocytes à l’aide de l’approche du fractionneur, le comptage automatique à l’aide d’algorithmes informatiques et la reconstruction 3D d’images histologiques pour éviter le comptage multiple du même ovocyte 31,32,33,34,35,36 . Même avec ces améliorations ajoutées à l’évaluation histomorphométrique, la technique est relativement exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études à grande échelle et à haut débit. Les données recueillies peuvent ne pas être reproductibles et comparables entre les études en raison des différences dans les schémas de comptage, les algorithmes informatiques et les logiciels utilisés.
Récemment, accélérées par le développement de nouvelles méthodes de microscopie multiphotonique et de feuille de lumière à moyenne résolution et de nettoyage optique des tissus, les techniques de modélisation et d’analyse 3D pour les ovaires intacts deviennent la méthode de choix pour quantifier efficacement le nombre d’ovocytes et étudier la localisation et la dynamique des protéines37,38. Ces méthodes 3D sont généralement avantageuses par rapport aux méthodes histologiques car les tissus et les organes sont mieux conservés et conservés intacts. De plus, l’analyse et la modélisation 3D fournissent des informations supplémentaires sur la fonction et les interactions au sein et entre les niches ou sous-structures cellulaires de l’organe qui peuvent être manquées dans l’analyse 2D.
L’analyse 3D d’organes entiers nécessite une optimisation des protocoles de fixation, d’immunocoloration et de nettoyage optique pour des organes individuels, tels que les ovaires, sans distorsion ou dommage tissulaire. Une optimisation supplémentaire du montage de l’échantillon pour l’imagerie est nécessaire pour la microscopie à haute résolution et peut dépendre de la plate-forme d’imagerie disponible. Enfin, l’imagerie de l’ensemble de l’ovaire intact génère une grande quantité de données pour les analyses informatiques ultérieures. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes 3D standardisées pour compter les ovocytes pour les études comparatives et à tous les stades de développement.
Ce protocole utilise des protocoles d’immunocoloration standard et de compensation précédemment rapportés, en se concentrant sur une approche simple, conviviale et à haut débit 38,39,40,41. Le protocole est optimisé pour analyser un grand nombre d’ovaires prénataux et postnatals jusqu’au jour postnatal 28 (P28) et différentes tailles d’ovaires de différents milieux génétiques de souris. Les étapes d’immunocoloration sont similaires pour toutes les étapes; cependant, les protocoles de clairance diffèrent pour les ovaires pubertaires en raison de leur plus grande taille, ScaleS4(0) et CUBIC pour les petits et grands ovaires, respectivement40,41. En outre, la perfusion du corps entier est effectuée chez les souris P28 avant la fixation pour prévenir l’autofluorescence des cellules sanguines. Un microscope multiphoton a été construit sur la plate-forme Leica DIVE/4Tune comme alternative à la microscopie à feuille de lumière pour acquérir des images, et le logiciel de visualisation et d’analyse 3D IMARIS avec divers outils analytiques a été choisi pour ce protocole. Ce protocole est simple à suivre et moins pratique, ce qui permet de gagner du temps. De plus, la quantification des ovocytes est relativement rapide, en fonction de la taille de l’ovaire et de la disposition des ovocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

La fertilité féminine et la durée de vie reproductive dépendent de la qualité et de la quantité de la réserve d’ovocytes ovariens. On estime que 80% des cellules germinales femelles entrant dans la prophase méiotique I sont éliminées pendant l’attrition ovocytaire fœtale (FOA) et la première semaine de vie postnatale. Trois mécanismes majeurs régulent le nombre d’ovocytes qui survivent pendant le développement et établissent la réserve ovarienne chez les femmes entrant dans la puberté. Dans la première vague de perte d’ovocytes, 30 à 50% des ovocytes sont éliminés au début de la FOA, un phénomène attribué à une expression élevée de l’élément nucléaire intercalaire long (LINE-1). La deuxième vague de perte d’ovocytes est l’élimination des ovocytes présentant des défauts méiotiques par un point de contrôle de qualité méiotique. La troisième vague de perte d’ovocytes se produit périnatalement lors de la formation de follicules primordiaux lorsque certains ovocytes ne parviennent pas à former des follicules. On ne sait toujours pas ce qui régule chacune de ces trois vagues de perte d’ovocytes et comment elles façonnent la réserve ovarienne chez la souris ou l’homme.
L’immunofluorescence et la visualisation 3D ont ouvert une nouvelle voie pour imager et analyser le développement des ovocytes dans le contexte de l’ensemble de l’ovaire plutôt que dans des sections 2D moins informatives. Cet article fournit un protocole complet pour l’immunocoloration des ovaires entiers et le nettoyage optique, produisant des préparations pour l’imagerie à l’aide de la microscopie multiphotonique et de la modélisation 3D à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce. Il montre comment cette méthode peut être utilisée pour montrer la dynamique de l’attrition ovocytaire au cours du développement ovarien chez les souris C57BL / 6J et quantifier la perte d’ovocytes au cours des trois vagues d’élimination des ovocytes. Ce protocole peut être appliqué aux ovaires prénataux et postnatals précoces pour la visualisation et la quantification des ovocytes, ainsi qu’à d’autres approches quantitatives. Il est important de noter que le protocole a été stratégiquement développé pour permettre un traitement à haut débit, fiable et reproductible qui peut répondre aux besoins en toxicologie, en diagnostic clinique et en tests génomiques de la fonction ovarienne.

L’immunocoloration et l’imagerie de l’ensemble de l’ovaire permettent la visualisation et la quantification des ovocytes ou de l’expression des protéines dans les ovaires à différents stades de développement en utilisant la même technique et les mêmes marqueurs (Figure 3). Ce protocole a été développé pour un projet à grande échelle dans lequel l’analyse des ovaires à plusieurs stades et de plusieurs souches de souris était nécessaire. Nous présentons ici les donn...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l’imagerie d’ovaires entiers pour des analyses quantitatives et qualitatives utilisant l’immunocoloration à montage entier, la microscopie multiphotonique et la visualisation et l’analyse 3D. Ce protocole prend en charge un traitement à haut débit, fiable et reproductible applicable à la toxicologie, au diagnostic clinique et aux tests génomiques de la fonction ovarienne.

Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Cette méthode peut aider à répondre à l’une des questions clés dans le domaine de la reproduction, à savoir comment et quand les processus génétiquement régulés influencent la taille de la réserve ovarienne dont nous savons qu’ils ont un impact sur les femelles, la longévité reproductive Ce protocole peut être adopté pour des études à grande échelle en utilisant les mêmes techniques pour les ovaires intacts de différents stades de développement. Il génère des données productibles en fournissant une quantification efficace des cellules germinales. Cette méthode appliquée à des animaux génétiquement divers de la même espèce peut fournir un aperçu des facteurs génétiques directement sur le développement des cellules germinales et des ovaires et d’autres organes de développement.Nathaniel Boechat, un stagiaire de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure Pour commencer par la place de l’étape de profusion et sécuriser la souris femelle pubère anesthésiée sur son dos en épinglant doucement toutes les jambes à travers les coussinets de pattes dans une position détendue sur une planche. Pour ouvrir la cavité thoracique de la souris, coupez soigneusement les côtes des deux côtés du sternum juste en dessous de l’omoplate, en évitant de percer les poumons, attrapez la peau ou les lambeaux de côtes avec la pince et épinglez les lambeaux pour exposer les organes internes utilisez des ciseaux à dissection pour couper l’oreillette droite du cœur et libérer le sang du système. Ensuite, en tenant le cœur avec une pince, insérez une aiguille de perfusion dans le ventricule gauche et pompez 10 millilitres de PBS avec une pression douce et constante.Lorsque les tissus tels que les reins du foie et l’appareil reproducteur sont passés du rose au blanc, remplacez le PBS par du paraformaldéhyde ou du PFA à 1% fraîchement préparé et poursuivez la perfusion avec environ 10 millilitres de PFA. Ensuite, localisez le coussinet adipeux avec les ovaires sous le rein et disséquez doucement l’ensemble de l’appareil reproducteur, y compris les ovaires du coussinet adipeux et les cornes utérines pour le placer dans un flacon contenant 4% de PFA. Fixez les ovaires à température ambiante pendant 16 à 24 heures avant de remplacer le PFA à 4% par de l’éthanol à 70%.Le jour de la coloration, coupez les ovaires avant de procéder à la coloration immunologique. Le premier jour du protocole de coloration immunologique, pipettez un millilitre de PBS par puits dans le nombre souhaité de puits dans une plaque propre de 24 puits. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 microlitres pour faire une large ouverture et utilisez la pointe large pour transférer doucement les ovaires pubertaires des flacons contenant 70% d’éthanol dans les puits, puis remplacez le PBS dans le puits par 0,8 millilitre de PBS le lendemain, aspirez le PBS des puits pour le remplacer par 0,8 millilitre du tampon de perméation par puits.Après avoir incubé les plaques sur le shaker à température ambiante pendant quatre heures, remplacez le tampon de perméation par un tampon bloquant Le troisième jour, préparez les anticorps primaires par dilution dans le tampon bloquant. Pour visualiser les ovocytes, incuber les ovaires prénatals et prépubères avec les marqueurs d’ovocytes. Le huitième jour, lavez les échantillons avec un tampon de lavage frais pendant deux heures, puis remplacez le tampon de lavage par 0,5 millilitre de mélanges d’anticorps secondaires dilués dans un tampon bloquant.Scellez la plaque avec un parafilm pour éviter l’évaporation et incuber les échantillons à température ambiante dans l’obscurité pendant trois jours. Le jour 11 après le lavage de coloration immunologique, aspirez le tampon de lavage et incubez les échantillons avec 0,8 millilitre de la solution cubique à 37 degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité. Changer l’échelle cubique une solution par jour.Le jour 15, lavez les échantillons trois fois pendant 10 minutes et 0,8 millilitre de PBS à température ambiante en secouant doucement. Remplacez ensuite le PBS par 0,8 millilitre de saccharose dégazé à 20% fraîchement préparé par du PBS, suivi d’une secousse douce à température ambiante. Après une heure, remplacez la solution de saccharose à 20% pour traiter les échantillons avec 0,8 millilitre de la solution cubique à deux degrés pendant quatre à cinq jours, comme expliqué précédemment.Pour préparer une mise en place d’échantillon, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec la coupure de la pointe pour transférer les ovaires pubertaires avec 15 à 20 microlitres de solution cubique à l’échelle deux au milieu du puits adhésif. Une fois que les ovaires sont transférés dans le puits individuel avec une goutte de solution de nettoyage, placez doucement un verre de couverture sur le puits adhésif et appuyez pour créer un joint prenant en sandwich les échantillons et la solution de nettoyage entre deux glissements de couverture. Pour le lieu d’imagerie, le couvercle est pris en sandwich dans une lame d’adaptateur de microscope imprimée en 3D.Configurez les paramètres d’acquisition d’images en fonction des noyaux de microscopie ou des spécifications du fabricant. Si disponible, utilisez l’acquisition d’image bidirectionnelle pour réduire le temps de numérisation et améliorer l’efficacité. Ajustez la moyenne des lignes, la moyenne des images et l’accumulation des images dans le logiciel.Configurez la pile Z en identifiant la position de début et de fin, puis sélectionnez une taille de pas Z de deux micromètres pour les ovaires prépubères et de cinq micromètres pour les ovaires pubertaires. Ensuite, activez la fonction de compensation Z et le gain d’excitation. Réglez la compensation Z pour le bas et le haut de l’échantillon en sélectionnant une intensité laser pour les deux.Utilisez le mode mosaïque pour les échantillons plus volumineux qui ne peuvent pas être capturés dans un seul champ de vision. Activez le navigateur d’images et indiquez le nombre de tuiles nécessaires pour capturer l’échantillon entier à l’aide de l’outil de marquage rectangulaire. Une fois le réglage terminé, commencez par l’acquisition d’images pour les images avec plusieurs vignettes, commencez l’acquisition d’images avec le navigateur pour capturer toutes les tuiles.Après l’acquisition de l’image, enregistrez toutes les images. Et si plusieurs mosaïques ont été acquises, exécutez l’outil de fusion de mosaïque pour fusionner les mosaïques en une seule image. Pour déterminer la taille des ovocytes, ouvrez l’image et sélectionnez l’option de tranche pour ouvrir l’image de la pile Zs.Sélectionnez l’option de ligne et le panneau de mesure et mesurez la distance en traçant une ligne d’un bord d’un ovocyte ou d’un marqueur à l’autre bord au point le plus large pour déterminer le diamètre X Y de l’ovocyte. Déplacez-vous dans la pile et obtenez la gamme de diamètres pour plusieurs ovocytes du même type. Utilisez la longueur la plus courte comme critère de sélection de la taille pour le nombre d’ovocytes.Ensuite, dans l’option de vue 3D, sélectionnez la fonction spots. Dans le panneau de scène, activez la fonction Ajouter de nouveaux spots pour ouvrir le panneau d’algorithme. Ensuite, désélectionnez tous les paramètres de l’algorithme comme filtre de sélection de taille avec la taille des ovocytes obtenue précédemment.Cliquez sur la flèche de transfert du canal pour accéder au canal source. Sélectionnez ensuite le canal avec le marqueur préféré et tapez le diamètre acquis dans le diamètre estimé X, Y. Après la sélection de la taille, activez l’allongement PSF du modèle et la soustraction d’arrière-plan qui sont automatiquement déterminés.Ensuite, choisissez la flèche unique vers l’avant pour accéder au panneau des points de filtre et ajoutez le filtre de qualité pour déterminer un seuil. Pour assurer l’estimation précise du nombre d’ovocytes, agrandissez l’image. Plus tard, cliquez sur la double flèche pour terminer les comptages automatisés.Utilisez l’onglet Modifier pour sélectionner manuellement les ovocytes manqués ou désélectionner les particules de non-ovocytes sélectionnées par le seuil automatique. Lorsque vous avez terminé, enregistrez les données dans l’onglet Statistiques sous l’onglet Global pour une analyse plus approfondie. Pour estimer le nombre total d’ovocytes et les ovaires endommagés, ouvrez des images des ovaires intacts avec MRS et sélectionnez la fonction de cadre.Sous les paramètres du cadre, cochez la case grille et accédez aux étiquettes. Dans l’onglet position XYZ, sélectionnez 200 microme pour générer des graduations avec des espaces de 200 micromètres dans toutes les positions XYZ. En utilisant les marques de tiques de 200 micromètres, sélectionnez les ovocytes qui tombent à moins de 50% du volume de chaque ovaire.Cliquez sur la fonction spots et sélectionnez les étiquettes d’édition pour classer les ovocytes qui se situent dans la région 50% par couleur. Dans les images multiphotoniques représentatives en niveaux de gris des ovaires non perfusés et perfusés, les petits ovocytes dans les follicules primordiaux avec la fine couche de coloration cytoplasmique DDX4 ont pu être vus. De plus, les plus gros ovocytes dans les follicules en croissance ont été repérés.Les rendus 3D des images multiphotoniques des ovaires prénatals et postnatals ont été étudiés. Au jour postnatal 28, l’ovaire de la femelle témoin non irradiée contenait une grande population de petits ovocytes dans les follicules primordiaux. En revanche, les ovaires de la femelle irradiée avec 0,5 gris du rayonnement gamma étaient complètement dépourvus de petits ovocytes dans les follicules primaires.Mais des ovocytes plus gros étaient toujours présents. Pour la quantification des ovocytes, les images multiphotoniques 3D ont été traitées dans le logiciel MRS à l’aide du filtre goucien et les ovocytes de petites et grandes tailles ont été identifiés et quantifiés à l’aide de la fonction spot. Ensuite, le pourcentage moyen d’ovocytes a été calculé à chaque étape par rapport au nombre moyen présent au stade le plus précoce E 15,5 le nombre d’ovocytes a fortement diminué entre E 15,5 et E 18,5 les ovocytes fœtaux E 15,5 et E 18,5 exprimés ligne un ou un P comme on le voit dans les images multiphotoniques.L’analyse d’intensité a montré des expressions plus élevées de la ligne un ou d’un P par ovocytes à E 18,5 qu’à E 15,5. Les ovaires avec de petits dommages peuvent être utilisés pour l’analyse. Le nombre total d’ovocytes est déterminé à l’aide d’une correction informatique.Le modèle représentatif montre des ovocytes G CNA positifs dans l’ovaire E 15,5 avec cinq régions de 10% mises en évidence dans un ovaire intact. De même, un ovaire simulé avec des régions incrémentielles de 10% manquant jusqu’à 50% de l’ovaire a été généré. Le nombre total d’ovocytes et les ovaires simulés ont été comparés aux ovaires intacts d’origine.Et la différence a été présentée comme l’écart en pourcentage Une bonne perfusion entraîne une bonne qualité d’image. Assurez-vous donc que tous les tissus sont nettoyés avec du PBS avant de passer au PFA. Assurez-vous que les ovaires sont complètement exposés en coupant le tissu supplémentaire.Le protocole permet une analyse efficace d’un grand nombre d’échantillons, les données quantitatives obtenues à partir de populations génétiques de référence telles que la production collaborative croisée ou de diversité aideront à identifier les modificateurs génétiques du développement des ovocytes et le nombre d’ovocytes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...