Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants unterstützt (R01 HD093778 bis E.B-F und T32 HD007065 bis R.B). Wir danken Zachary Boucher für seine Unterstützung beim Strahlenexperiment. Wir danken Mary Ann Handel für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Sonia Erattupuzha und dem Microscopy Core Service am Jackson Laboratory für die fachkundige Unterstützung bei der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Mikroskopiearbeit und Jarek Trapszo von den Scientific Instrument Services am Jackson Laboratory für die Gestaltung des 3D-gedruckten Adapterdias.

Alle verwendeten Mäuse gehörten dem genetischen Stamm C57BL/6J an (siehe Materialtabelle). Dieser Stamm wurde vollständig sequenziert und ist Standard für viele Studien zur Struktur und Funktion der Eierstöcke. Mäuse wurden gemäß den NIH-Richtlinien untergebracht, und die durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Jackson Laboratory genehmigt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Zusammensetzungen sind in der Materialtabelle...

Dieser Artikel stellt ein detailliertes 3D-Immunfärbungs- und Bildgebungsprotokoll für pränatale und postnatale Eierstöcke für Hochdurchsatz- und Vergleichsstudien zur Keimzellquantifizierung und Proteinlokalisierung vor. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Anzahl der Eizellen in den Eierstöcken (N = 6-12) an sechs Entwicklungszeitpunkten in 10-16 verschiedenen Stämmen zu analysieren, wobei typischerweise 2-4 24-Well-Platten gleichzeitig verarbeitet werden. Diese Methode kann für andere Organe oder zell...

Die meisten weiblichen Säugetiere werden mit einer endlichen Anzahl von meiotisch stillgelegten Eizellen geboren, die in den Urfollikeln gespeichert sind und die Eierstockreserve (OR) bilden1,2. Der OP bestimmt die gesamte weibliche reproduktive Lebenserwartung und Gesundheit3. Der OP nimmt normalerweise mit zunehmendem Alter ab und kann bei Exposition gegenüber bestimmten genotoxischen Wirkstoffen (Bestrahlung / Chemotherapie) und Umweltbelastungen (Unterernährung) vorzeitig erschöpft sein, was zu Unfruchtbarkeit führt 4,5,6. Idiopathische weibliche Unfruchtbarkeit kann oft auf die genetische und physiologische Qualität von Eiern zurückgeführt werden, die sich aus dem OP entwickeln, und bleibt schlecht verstanden 7,8. Da die weibliche Follikelausstattung weitgehend durch die Geburt vorbestimmt ist, ist es wichtig, die regulatorischen Mechanismen zu verstehen, die an der Einrichtung und Aufrechterhaltung der OP beteiligt sind.
Bei Mäusen beginnt die OP-Bildung mit der Spezifizierung von primordialen Keimzellen (PGCs) um den Embryonaltag (E) 7.52. Die PGCs wandern zu den Genitalrücken, wo sie sich um etwa E10,59 befinden werden. Die folgende ausgedehnte Proliferation tritt bei unvollständiger Zytokinese auf, was zur Bildung von Zysten führt, die später in der Entwicklung abgebaut werden10,11. Bei ungefähr E12,5 wird das Gonadengeschlecht bestimmt, und die PGC-Proliferation stoppt in den Eierstöcken. Bei Weibchen treten PGCs, jetzt Eizellen, bei etwa E13,512,13 in die meiotische Prophase I (MPI) ein. Die Eizellen durchlaufen eine ausgedehnte MPI und eine Verhaftung im Diktate um die Zeit der Geburt. In der ersten Woche nach der Geburt ist jede festsitzende Eizelle von Granulosazellen umgeben und bildet dadurch einen Urfollikel.
Die Anzahl der Urfollikel im OP eines Weibchens hängt davon ab, wie viele Eizellen die Wellen der Eizellelimination überlebt haben, die vor und während des MPI-Stillstands durch Apoptose, Autophagie oder Nekrose auftreten14,15. Die erste Welle tritt während der fetalen Entwicklung auf und wird als FOA bezeichnet. FOA ist ein evolutionär konservierter Prozess bei Weibchen (Säugetiere und Nicht-Säugetiere), wobei schätzungsweise 50-80% der Eizellen je nach weiblicher Art16,17,18,19 eliminiert werden. Bei Mäusen tritt FOA während E15.5 bis E18.5 auf und wurde auf die Reaktivierung und Expression von Retrotransposon-LINE-1-Sequenzen zurückgeführt, die zum Tod der Eizellen20,21 führten. Die zweite Welle der Eizellelimination erfolgt durch einen meiotischen Checkpoint, der Eizellen mit meiotischen Defekten wie nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) eliminiert22,23. Die nächste Welle der Eizellelimination tritt während des Zystenabbaus auf und gipfelt in der Bildung von Urfollikeln, von denen jede eine einzelne Eizelle 10,11,24,25 enthält.
Bei Mäusen wird die ursprüngliche Follikelreserve weitgehend durch die Pubertät festgelegt, danach nimmt sie ab, da die primordialen Follikel während regelmäßiger Fortpflanzungszyklen für das Wachstum aktiviert werden. Die OP-Größe variiert zwischen einzelnen Frauen und zwischen verschiedenen genetischen Stämmen von Mäusen; Die genetische Regulation der OP-Größe ist jedoch nicht gut verstanden26,27,28,29. Genetische Studien der OP-Regulation werden durch das Fehlen standardisierter Protokolle zur Untersuchung der Wellen der Eizellelimination während der pränatalen und postnatalen Entwicklung behindert. Mehrere Methoden zur Quantifizierung von Eizellen wurden an Mäusen entwickelt, wobei die häufigste und am weitesten verbreitete histomorphometrische Auswertung histomorphometrischer Abschnitte30,31 ist. Bei dieser Technik werden Eizellen auf seriellen Abschnitten mit histologischen Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin (H & E) und periodischer Säure-Schiff (PAS) oder fluoreszierenden Markern identifiziert. Diese Technik ist zuverlässig, wenn alle Bedingungen konstant bleiben, einschließlich der Abschnittsdicke, der effizienten Wiederherstellung aller Abschnitte im gesamten Eierstock und der Zählschemata der einzelnen Laboratorien. Die von verschiedenen Labors gemeldeten Zahlen unterscheiden sich jedoch oft erheblich und sind daher nicht leicht vergleichbar.
Darüber hinaus kann die Verwendung verschiedener Mausstämme angesichts genetischer Unterschiede auch die Anzahl der Eizellen beeinflussen. Weitere Berechnungsansätze wurden für die histomorphometrische Auswertung entwickelt und umfassen die automatisierte Erkennung von Eizellen mit dem Fraktionierungsansatz, die automatische Zählung mit Rechenalgorithmen und die 3D-Rekonstruktion histologischer Bilder, um eine Mehrfachzählung derselben Eizellezu verhindern 31,32,33,34,35,36 . Selbst wenn diese Verbesserungen der histomorphometrischen Auswertung hinzugefügt werden, ist die Technik relativ arbeitsintensiv, insbesondere für groß angelegte und Hochdurchsatzstudien. Die gesammelten Daten sind aufgrund von Unterschieden in den Zählschemata, Computeralgorithmen und der verwendeten Software möglicherweise nicht reproduzierbar und zwischen den Studien vergleichbar.
In jüngster Zeit, beschleunigt durch die Entwicklung neuer Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie mit mittlerer Auflösung und optischer Gewebereinigungsmethoden, werden 3D-Modellierungs- und Analysetechniken für intakte Eierstöcke zur Methode der Wahl, um die Anzahl der Eizellen effizient zu quantifizieren und die Proteinlokalisierung und -dynamikzu untersuchen 37,38. Diese 3D-Methoden sind typischerweise vorteilhaft gegenüber histologischen Methoden, da Gewebe und Organe besser erhalten und intakt gehalten werden. Darüber hinaus liefern 3D-Analyse und -Modellierung zusätzliche Einblicke in Funktionen und Wechselwirkungen innerhalb und zwischen Zellnischen oder Substrukturen innerhalb des Organs, die bei der 2D-Analyse übersehen werden können.
Die 3D-Analyse ganzer Organe erfordert die Optimierung von Fixations-, Immunfärbungs- und optischen Clearingprotokollen für einzelne Organe wie Eierstöcke ohne Gewebeverzerrung oder -schädigung. Eine zusätzliche Optimierung der Probenmontage für die Bildgebung ist für die hochauflösende Mikroskopie erforderlich und kann von der verfügbaren Bildgebungsplattform abhängen. Schließlich erzeugt die Bildgebung des gesamten intakten Eierstocks eine große Datenmenge für nachfolgende Rechenanalysen. Daher besteht die Notwendigkeit, standardisierte 3D-Methoden zur Zählung von Eizellen für vergleichende Studien und über Entwicklungsstadien hinweg zu entwickeln.
Dieses Protokoll verwendet Standard-Immunfärbungs- und zuvor berichtete Clearing-Protokolle und konzentriert sich auf einen einfachen, benutzerfreundlichen und Hochdurchsatz-Ansatz 38,39,40,41. Das Protokoll ist optimiert, um eine große Anzahl pränataler und postnataler Eierstöcke bis zum postnatalen Tag 28 (P28) und unterschiedliche Größen von Eierstöcken aus verschiedenen genetischen Hintergründen der Maus zu analysieren. Die Immunfärbungsschritte sind für alle Stadien ähnlich; Die Clearingprotokolle unterscheiden sich jedoch für pubertäre Eierstöcke aufgrund ihrer größeren Größe, ScaleS4(0) und CUBIC für kleine und große Eierstöcke bzw.40,41. Darüber hinaus wird bei P28-Mäusen vor der Fixierung eine Ganzkörperperfusion durchgeführt, um die Autofluoreszenz von Blutzellen zu verhindern. Auf der Leica DIVE/4Tune-Plattform wurde ein Multiphotonenmikroskop als Alternative zur Lichtblattmikroskopie zur Bilderfassung entwickelt, und für dieses Protokoll wurde die IMARIS 3D-Visualisierungs- und Analysesoftware mit verschiedenen Analysewerkzeugen ausgewählt. Dieses Protokoll ist einfach zu befolgen und weniger praktisch, daher zeitsparend. Darüber hinaus ist die Quantifizierung der Eizellen relativ schnell, abhängig von der Größe des Eierstocks und der Anordnung der Eizellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Die weibliche Fruchtbarkeit und die reproduktive Lebensdauer hängen von der Qualität und Quantität der Eierstock-Eizellreserve ab. Schätzungsweise 80% der weiblichen Keimzellen, die in die meiotische Prophase I eintreten, werden während der fetalen Eizellabnutzung (FOA) und der ersten Woche des postnatalen Lebens eliminiert. Drei Hauptmechanismen regulieren die Anzahl der Eizellen, die während der Entwicklung überleben, und etablieren die Eierstockreserve bei Frauen, die in die Pubertät eintreten. In der ersten Welle des Eizellverlustes werden 30-50% der Eizellen während der frühen FOA eliminiert, ein Phänomen, das auf eine hohe lange eingestreute Kernelement-1 (LINE-1) -Expression zurückzuführen ist. Die zweite Welle des Eizellverlustes ist die Beseitigung von Eizellen mit meiotischen Defekten durch einen meiotischen Qualitätskontrollpunkt. Die dritte Welle des Eizellverlustes tritt perinatal während der primordialen Follikelbildung auf, wenn einige Eizellen keine Follikel bilden. Es bleibt unklar, was jede dieser drei Wellen des Eizellverlustes reguliert und wie sie die Eierstockreserve bei Mäusen oder Menschen formen.
Immunfluoreszenz und 3D-Visualisierung haben einen neuen Weg eröffnet, um die Entwicklung von Eizellen im Kontext des gesamten Eierstocks abzubilden und zu analysieren, anstatt in weniger informativen 2D-Schnitten. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll für die Immunfärbung des gesamten Eierstocks und die optische Reinigung, das Vorbereitungen für die Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie und 3D-Modellierung mit kommerziell verfügbarer Software liefert. Es zeigt, wie diese Methode verwendet werden kann, um die Dynamik der Eizellabnutzung während der Eierstockentwicklung bei C57BL/6J-Mäusen zu zeigen und den Eizellverlust während der drei Wellen der Eizellelimination zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auf pränatale und frühe postnatale Eierstöcke zur Visualisierung und Quantifizierung von Eizellen sowie auf andere quantitative Ansätze angewendet werden. Wichtig ist, dass das Protokoll strategisch entwickelt wurde, um eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, die die Anforderungen in der Toxikologie, klinischen Diagnostik und genomischen Assays der Eierstockfunktion erfüllen kann.

Die Immunfärbung und Bildgebung des gesamten Eierstocks ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Eizell- oder Proteinexpression in Eierstöcken in verschiedenen Entwicklungsstadien mit derselben Technik und denselben Markern (Abbildung 3). Dieses Protokoll wurde für ein Großprojekt entwickelt, in dem die Analyse von Eierstöcken in mehreren Stadien und aus mehreren Mausstämmen erforderlich war. Hier präsentieren wir Daten, die für den Stamm C57BL6/J, einen Standardstamm f...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Diese Methode kann helfen, eine der Schlüsselfragen im reproduktiven Bereich zu beantworten, nämlich wie und wann genetisch regulierte Prozesse die Größe der Eierstockreserve beeinflussen, von der wir wissen, dass sie sich auf Weibchen auswirkt, die Langlebigkeit der Fortpflanzung Dieses Protokoll kann für groß angelegte Studien mit den gleichen Techniken für intakte Eierstöcke aus verschiedenen Entwicklungsstadien übernommen werden. Es generiert herstellbare Daten, indem es eine effiziente Quantifizierung von Keimzellen ermöglicht. Diese Methode, die auf genetisch unterschiedliche Tiere derselben Art angewendet wird, kann einen Einblick in die genetischen Faktoren geben, die direkt die Entwicklung von Keimzellen und Eierstöcken und andere Entwicklungsorgane betreffen.Nathaniel Boechat, ein Forschungspraktikant aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren Um mit der Fülle-Schrittstelle zu beginnen und die betäubte pubertäre weibliche Maus auf dem Rücken zu sichern, indem er alle Beine sanft durch die Pfotenpolster in einer entspannten Position auf ein Brett pinnt. Um die Brusthöhle der Maus zu öffnen, schneiden Sie vorsichtig die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins direkt unter dem Schulterblatt, vermeiden Sie es, die Lunge zu punktieren, greifen Sie die Haut oder die Rippenklappen mit der Pinzette und stecken Sie die Klappen fest, um die inneren Organe freizulegen, verwenden Sie eine Dissektionsschere, um den rechten Vorhof des Herzens zu schneiden und Blut aus dem System freizusetzen. Führen Sie dann durch Halten des Herzens mit einer Pinzette eine Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und pumpen Sie 10 Milliliter PBS mit einem sanften und konstanten Druck.Wenn die Gewebe wie die Lebernieren und der Fortpflanzungstrakt von rosa nach weiß werden, ersetzen Sie das PBS durch frisch hergestelltes 1% Paraformaldehyd oder PFA und setzen die Perfusion mit etwa 10 Millilitern PFA fort. Als nächstes lokalisieren Sie das Fettpolster mit den Eierstöcken unterhalb der Niere und sezieren Sie vorsichtig den gesamten Fortpflanzungstrakt einschließlich der Fettpad-Eierstöcke und Uterushörner, um es in eine Durchstechflasche mit 4% PFA zu legen. Fixieren Sie die Eierstöcke bei Raumtemperatur für 16 bis 24 Stunden, bevor Sie die 4% PFA durch 70% Ethanol ersetzen.Am Tag der Färbung schneiden Sie die Eierstöcke ab, bevor Sie mit der Immunfärbung fortfahren. Am ersten Tag des Immunfärbeprotokolls pipettierte ein Milliliter PBS pro Vertiefung in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer sauberen 24-Well-Platte. Schneiden Sie die Spitze einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab, um eine breite Öffnung zu machen, und verwenden Sie die breite Spitze, um die pubertären Eierstöcke vorsichtig von Fläschchen mit 70% Ethanol in die Brunnen zu übertragen, dann ersetzen Sie PBS im Bohrloch durch frische 0,8 Milliliter PBS Am nächsten Tag aspirieren Sie PBS aus den Bohrlöchern, um es durch 0,8 Milliliter des Permeationspuffers pro Vertiefung zu ersetzen.Nach dem Inkubieren der Platten auf dem Shaker bei Raumtemperatur für vier Stunden ersetzen Sie den Permeationspuffer durch Blockpuffer Am dritten Tag bereiten Sie die primären Antikörper durch Verdünnung im Blockpuffer vor. Um die Eizellen zu visualisieren, inkubieren die pränatalen und präpubertären Eierstöcke mit den Eizellmarkern. Am achten Tag die Proben zwei Stunden lang mit einem frischen Waschpuffer waschen und dann den Waschpuffer durch 0,5 Milliliter der in einem Blockpuffer verdünnten sekundären Antikörpermischungen ersetzen.Verschließen Sie die Platte mit einem Parafilm, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie die Proben drei Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Tag 11 nach der Immunfärbungswäsche den Waschpuffer absaugen und die Proben mit 0,8 Millilitern der Skala kubische eine Lösung bei 37 Grad Celsius für drei Tage im Dunkeln inkubieren. Ändern der Skala cubic eine Lösung täglich.Waschen Sie die Proben am 15. Tag dreimal für 10 Minuten und 0,8 Milliliter PBS bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln. Dann ersetzen Sie das PBS durch 0,8 Milliliter der frisch zubereiteten entgasten 20%igen Saccharose mit PBS, gefolgt von sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde ersetzen Sie die 20%ige Saccharoselösung, um die Proben mit 0,8 Millilitern der kubischen Zweierlösung für vier bis fünf Tage zu behandeln, wie zuvor erläutert.Um eine Probeneinrichtung vorzubereiten, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit dem Spitzenschnitt, um die pubertären Eierstöcke mit 15 bis 20 Mikrolitern kubischer Zweifachlösung in die Mitte der Klebevertiefung zu übertragen. Sobald die Eierstöcke mit einem Tropfen Clearinglösung in den einzelnen Brunnen überführt wurden, legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Klebeschacht und drücken Sie, um eine Versiegelung zu schaffen, die die Proben und die Clearinglösung zwischen zwei Deckgläsern aufnimmt. Für die Bildgebung platzieren Sie das Abdeckschlittensandwich in einem 3D-gedruckten Mikroskopadapterobjektträger.Richten Sie die Parameter für die Bildaufnahme nach den Mikroskopiekernen oder den Herstellerangaben ein. Falls verfügbar, verwenden Sie die bidirektionale Bildaufnahme, um die Scanzeit zu reduzieren und die Effizienz zu verbessern. Passen Sie den Liniendurchschnitt, den Rahmendurchschnitt und die Rahmenakkumulation in der Software an.Richten Sie den Z-Stapel ein, indem Sie die Anfangs- und die Endposition identifizieren und dann eine Z-Schrittgröße von zwei Mikrometern für präpubertäre Eierstöcke und fünf Mikrometer für pubertäre Eierstöcke auswählen. Als nächstes aktivieren Sie die Z-Kompensationsfunktion und den Erregungsgewinn. Stellen Sie die Z-Kompensation für die Unter- und Oberseite der Probe ein, indem Sie für beide eine Laserintensität auswählen.Verwenden Sie den Kachelmodus für größere Stichproben, die nicht in einem einzigen Sichtfeld erfasst werden können. Aktivieren Sie den Bildnavigator und geben Sie die Anzahl der Kacheln an, die zum Erfassen der gesamten Probe mit dem rechteckigen Markierungswerkzeug erforderlich sind. Sobald die Einstellung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Bilder mit mehreren Kacheln, beginnen Sie mit der Bildaufnahme mit dem Navigator, um alle Kacheln zu erfassen.Speichern Sie nach der Bildaufnahme alle Bilder. Und wenn mehrere Kacheln erworben wurden, führen Sie das Mosaik-Zusammenführungswerkzeug aus, um die Kacheln zu einem einzigen Bild zusammenzuführen. Um die Größe der Eizellen zu bestimmen, öffnen Sie das Bild und wählen Sie die Slice-Option, um das Zs-Stack-Bild zu öffnen.Wählen Sie die Linienoption und das Messfeld aus und messen Sie den Abstand, indem Sie eine Linie von einer Kante einer Eizelle oder Markierung zur anderen Kante an der breitesten Stelle zeichnen, um den X-Y-Durchmesser der Eizelle zu bestimmen. Bewegen Sie sich durch den Stapel und erhalten Sie den Durchmesserbereich für mehrere Eizellen desselben Typs. Verwenden Sie die kürzeste Länge als Größenauswahlkriterium für die Anzahl der Eizellen.Wählen Sie als Nächstes in der Option 3D-Ansicht die Fleckenfunktion aus. Aktivieren Sie im Szenenfenster die Funktion Neue Flecken hinzufügen, um das Algorithmusbedienfeld zu öffnen. Deaktivieren Sie dann alle Algorithmuseinstellungen als Größenauswahlfilter mit der zuvor erhaltenen Eizellgröße.Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil des Kanals, um zum Quellkanal zu gelangen. Wählen Sie dann den Kanal mit dem bevorzugten Marker aus und geben Sie den erfassten Durchmesser in den geschätzten X-, Y-Durchmesser ein. Nach der Größenauswahl aktivieren Sie das Modell PSF-Dehnung und Hintergrundsubtraktion, die automatisch ermittelt werden.Wählen Sie dann den einzelnen Vorwärtspfeil aus, um zum Bedienfeld "Filterpunkte" zu wechseln, und fügen Sie den Qualitätsfilter hinzu, um einen Schwellenwert zu bestimmen. Um die genaue Schätzung der Anzahl der Eizellen zu gewährleisten, vergrößern Sie das Bild. Klicken Sie später auf den Doppelpfeil, um die automatischen Zählungen abzuschließen.Verwenden Sie die Registerkarte Bearbeiten, um verpasste Eizellen manuell auszuwählen, oder heben Sie die Auswahl von Nicht-Eizellpartikeln auf, die durch den automatischen Schwellenwert ausgewählt wurden. Wenn Sie fertig sind, notieren Sie die Daten auf der Registerkarte Statistiken unter der Registerkarte "Gesamt" für weitere Analysen. Um die Gesamtzahl der Eizellen und die geschädigten Eierstöcke zu schätzen, öffnen Sie Bilder der intakten Eierstöcke mit MRS und wählen Sie die Rahmenfunktion.Wählen Sie unter den Rahmeneinstellungen das Kästchenraster, die Teilstriche und Zugriffsbeschriftungen aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Position XYZ die Option 200 Mikrometer aus, um in allen XYZ-Positionen Teilstriche mit 200 Mikrometern zu erzeugen. Wählen Sie anhand der 200-Mikrometer-Tick-Markierungen Eizellen aus, die innerhalb von 50% des Volumens jedes Eierstocks liegen.Klicken Sie auf die Fleckenfunktion und wählen Sie die Bearbeitungsetiketten aus, um die Eizellen, die in den 50%-Bereich fallen, nach Farbe zu klassifizieren. In den repräsentativen Graustufen-Multiphotonenbildern der nicht durchbluteten und durchbluteten Eierstöcke waren die kleinen Eizellen in den primordialen Follikeln mit der dünnen Schicht zytoplasmatischer DDX4-Färbung zu sehen. Zusätzlich wurden die größeren Eizellen in den wachsenden Follikeln gesichtet.Die 3D-Darstellungen aus den Multiphotonenbildern der pränatalen und postnatalen Eierstöcke wurden untersucht. Am postnatalen Tag 28 enthielt der Eierstock des nicht bestrahlten Kontrollweibchens eine große Population kleiner Eizellen in den Urfollikeln. Im Gegensatz dazu waren die Eierstöcke des bestrahlten Weibchens mit 0,5 Grau der Gammastrahlung völlig frei von kleinen Eizellen in den Primärfollikeln.Aber größere Eizellen waren immer noch vorhanden. Für die Quantifizierung der Eizellen wurden die 3D-Multiphotonenbilder in der MRS-Software unter Verwendung des Goucian-Filters verarbeitet und die Eizellen kleiner und großer Größe mit dem Spot-Feature identifiziert und quantifiziert. Als nächstes wurde der durchschnittliche Prozentsatz der Eizellen in jeder Phase im Vergleich zu der durchschnittlichen Anzahl berechnet, die im frühesten Stadium vorhanden war E 15,5 Eizellenzahlen nahmen zwischen E 15,5 und E 18,5 stark ab, die E 15,5 und E 18,5 fetalen Eizellen exprimierten Linie eins oder ein P, wie in den Multiphotonenbildern zu sehen ist.Die Intensitätsanalyse zeigte höhere Expressionen der Linie eins oder ein P pro Eizelle bei E 18,5 als E 15,5. Die Eierstöcke mit kleinen Schäden können zur Analyse verwendet werden. Die Gesamtzahl der Eizellen wird durch rechnerische Korrektur bestimmt.Das repräsentative Modell zeigt G CNA-positive Eizellen im Eierstock E 15,5 mit fünf 10%-Regionen, die in einem intakten Eierstock hervorgehoben sind. In ähnlicher Weise wurde ein simulierter Eierstock mit 10% inkrementellen Regionen erzeugt, in denen bis zu 50% des Eierstocks fehlten. Die Gesamtzahl der Eizellen und die simulierten Eierstöcke wurden mit den ursprünglichen intakten Eierstöcken verglichen.Und der Unterschied wurde als prozentuale Abweichung dargestellt Gute Perfusion führt zu einer guten Bildqualität. Stellen Sie also sicher, dass alle Gewebe mit PBS gereinigt werden, bevor Sie zu PFA wechseln. Stellen Sie sicher, dass die Eierstöcke vollständig freigelegt sind, indem Sie das zusätzliche Gewebe abschneiden.Das Protokoll ermöglicht eine effiziente Analyse einer großen Anzahl von Proben, quantitative Daten aus genetischen Referenzpopulationen wie kollaborative Kreuz- oder Diversitätsergebnisse werden dazu beitragen, genetische Modifikatoren der Eizellenentwicklung und der Anzahl der Eizellen zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...